Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 4:07 мин. • July 8th, 2025
Технология капельной цифровой полимеразной цепной реакции или дПЦР разделяет реагенты одной ПЦР-реакции на миллионы нанокапельных ПЦР-реакций. Это массовое разделение с последующей амплификацией обнаруживает небольшое количество мутантной ДНК на большом фоне ДНК дикого типа, что позволяет обнаруживать рак на ранней стадии.
Для начала аспирируйте мастер-смесь для дПЦР, содержащую флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, а также другие реагенты для ПЦР и стабилизирующее капли масло. Добавляйте эту исходную смесь непосредственно на дно каждой лунки в пробирку для полоски ПЦР, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Далее добавьте образцы ДНК в реакционную смесь и несколько раз пипеткой перемешайте.
Теперь перенесем всю реакционную смесь в специализированный чип каплевидного прибора. Установите новую полосковую пробирку для ПЦР на каплеуловый инструмент. Генератор капель объединяет образец и масло для образования дискретных нанокапель с инкапсулированной областью, которая предотвращает перекрестное загрязнение между каплями.
После завершения дроплетизации перенесите полосковую пробирку для ПЦР в термоамплификатор для амплификации целевой ДНК. Затем загрузите продукт ПЦР в считыватель капель, содержащий флуоресцентный детектор, который подсчитывает флуоресцентные положительные и отрицательные капли. Количество положительных капель может быть использовано для расчета целевой концентрации ДНК в образце.
Перед началом процедуры капельной цифровой ПЦР очистите место на столе и оборудование с помощью 10% отбеливателя и 70% этанола, а затем аккуратно перебейте и кратковременно центрифугируйте все реагенты, за исключением масла, стабилизирующего капли. Убедитесь, что баллон со сжатым азотом прикреплен к прибору, генерирующему капли, и что бак баллона установлен на 90 фунтов на квадратный дюйм. Добавьте 38 микролитров реакционной смеси цифровой ПЦР непосредственно на дно каждой лунки 8-луночной полоски для ПЦР-пробирки, удаляя любые пузырьки с помощью чистого наконечника для пипетки.
Добавьте 12 микролитров предварительно амплифицированного образца ДНК в трех экземплярах в соответствующие лунки трубки-полоски. Аккуратно пипетируйте весь объем 10 раз, чтобы смешать реакционную смесь с образцом ДНК, и направьте весь объем из каждой лунки в соответствующие каналы от A до H микросхемы прибора, генерирующего капли. Вставьте новую полоску для ПЦР-пробирки в прибор для генерации капель и отсканируйте идентификатор чипа инструмента, генерирующего капли, в программное обеспечение на компьютере прибора.
Затем нажмите «Начать прогон», чтобы начать дроплетизацию образцов. Когда капельная капля будет завершена, снимите полоску для ПЦР-пробирки и наложите колпачки на пробирку. Перенесите трубную полоску в термоамплификатор и уравновесьте трубку другой трубкой, содержащей 80 микролитров воды на лунку. Затем запустите термоамплификатор в соответствующих условиях термоциклирования. Замените полосовые колпачки на высокоскоростные колпачки.
Когда термоциклирование будет завершено, перенесите полоску трубки в прибор для количественного анализа. Нажмите «Настроить прогон» в программном обеспечении прибора и поместите полоску трубки в прибор для количественного анализа. Поместите металлический экран поверх нового чипа прибора для количественного анализа. Отсканируйте идентификатор чипа в приборе и вставьте чип в машину. Закройте крышку прибора. В компьютерной программе введите название для цифрового прогона ПЦР и для каждого из восьми каналов. Затем выберите «Быстрый режим» и нажмите «Начать», чтобы начать количественную оценку.