Флуоресцентное мечение клеток глиомы: метод трансфекции на основе лентивирусного вектора для получения клеток глиомы, экспрессирующих флуоресцентный белок для визуализации глубоких тканей

Визуализация рака мозга in vivo включает в себя введение флуоресцентно меченых раковых клеток в мозг мыши для наблюдения за развитием опухоли. Для флуоресцентного мечения инкубируйте клетки глиомы с частицами лентивируса. Лентивирусный вектор несет ген инфракрасного флуоресцентного белка iRFP.

Вирус связывается с поверхностью клетки глиомы и высвобождает РНК в клетку. Клеточные ферменты преобразуют вирусную РНК в двухцепочечную ДНК, которая интегрируется в клеточный геном и обеспечивает экспрессию iRFP. Максимумы возбуждения и излучения iRFP находятся в ближней инфракрасной области, где ткани имеют минимальное поглощение и рассеяние. Это позволяет точно визуализировать глубокие ткани.

Далее удаляем отработанное среднее и добавляем трипсин. Трипсин, фермент протеаза, переваривает адгезионные белки, отделяя клетки от поверхности колбы. Многократно пипетка, чтобы разделить отдельные клетки. Соберите клеточную суспензию в пробирку и центрифугу. Теперь добавьте подходящий буфер для ресуспендирования гранулы.

Дозируйте клеточную суспензию в пробирки проточной цитометрии и окрашивайте клетки флуоресцентным красителем DAPI. DAPI окрашивает ядра мертвых клеток в ярко-синий цвет, отличая их от живых клеток. С помощью флуоресцентно-активируемого клеточного сортировщика или FACS отсортируйте живые iRFP-положительные клетки из других клеточных популяций на основе их флуоресценции. Выделенные клетки могут быть использованы для инъекции мышам для визуализации опухоли.

Начните с посева 1 раз с 10 по шестую клетки глиобластомы по 5 миллилитров среды в 10-сантиметровую посуду для 24-часовой инкубации в инкубаторе для клеточных культур. На следующее утро трансдуцируйте клетки лентивирусом, экспрессирующим соответствующий флуоресцентный белок, представляющий интерес при кратности инфекции 5, и верните клетки в инкубатор.

Через 24 часа замените надосадочную жидкость на 5 миллилитров свежей среды и выдержите культуру еще 48 часов. В конце инкубации замените среду 3-5 миллилитрами трипсина в течение 10-15 минут при температуре 37 градусов Цельсия, после чего тщательно пипетируйте для полного диссоциирования отделенных клеток.

Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах сортировочного раствора. Разделите клетки на соответствующее количество трубок FACS и закрепите клетки DAPI для исключения мертвых клеток. Затем загрузите пробирки на проточный цитометр и отсортируйте живые клетки в соответствии с их экспрессией флуоресцентных конструкций в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую свежий сортировочный раствор.

После центрифугирования ресуспендируйте конструктив-положительные/DAPI-отрицательные клетки в 5 миллилитрах питательной среды и высадите их на новую 10-сантиметровую чашку для их культивирования при температуре 37 градусов Цельсия на 48-72 часа. В конце инкубации разделите клетки для посева на несколько чашек для последующих экспериментов in vivo.