Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 4:15 мин. • July 8th, 2025
Стволовые клетки опухоли головного мозга или BTSC, субпопуляция опухолевых клеток головного мозга, могут инициировать рост опухоли и метастазирование, что делает их перспективными мишенями для терапии рака. Чтобы изучить влияние лекарственных препаратов на миграцию БТСК in vitro, во-первых, готовят однородные суспензии ДТСК в подходящей среде. Обработайте одну из суспензий интересующим препаратом.
Между тем, получите многолуночную хемотаксисную пластину, состоящую из мембранных вставок, которые разделяют каждую лунку на верхнюю и нижнюю камеры. Пипеткой желательно подавать белок внеклеточного матрикса в нижние камеры и мембранные вставки. Инкубируйте для облегчения полимеризации белка.
Добавьте подходящую базальную среду, содержащую желаемый хемоаттрактант, в нижние камеры и поместите поверх мембранных вставок. Далее засейте обработанную лекарственным препаратом и необработанную суспензию BTSC в мембранные вкладыши. Визуализируйте планшет в течение длительного времени с помощью микроскопии живых клеток.
В культуре BTSC прилипают к белковой матрице вкладыша. В ответ на градиент концентрации хемоаттрактанта, установленный между верхней и нижней камерами, необработанные БТСК мигрируют через белковую матрицу через поры мембранной вставки в нижнюю камеру.
Однако лечение препаратом негативно влияет на функциональную активность клеток, снижая миграцию BTSC. Теперь, используя подходящее программное обеспечение, проанализируйте и количественно оцените мигрировавшие BTSC в нижних камерах. У необработанных BTSC наблюдается повышенная миграция, в то время как у обработанных препаратами BTSC наблюдается сниженная миграция.
Чтобы оценить влияние представляющего интерес лекарственного препарата на миграцию, во-первых, предварительно обрабатывают клетки соответствующей концентрацией препарата в течение подходящего экспериментального периода. Для подготовки хемотаксис-планшета покройте три мембранные вставные лунки и три донные скважины-резервуара в каждом состоянии 96-луночной хемотаксис-пластины 75 и 225 микролитрами 0,2 миллиграмма на миллилитр коллагена I типа, соответственно, в течение 1 часа при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации отасывайте раствор коллагена из каждой лунки, не царапая коллагеновое покрытие, и дважды промойте лунки стерильным ПБС. После последней промывки снимите вкладыш с пластины и добавьте 225 микролитров среды без фактора роста с добавлением 10% FBS в каждую нижнюю емкость пластины хемотаксиса.
Затем аккуратно верните верхнюю вставку в нижний резервуар под углом, чтобы избежать образования пузырьков, и добавьте в каждую лунку в 2,5 раза по 10 к трети диссоциированных BTSC в 50 микролитрах среды без фактора роста. Важно полностью диссоциировать BTSC на отдельные клетки и тщательно подсчитать их перед нанесением покрытия, чтобы избежать скопления клеток или слишком большого количества клеток в верхней вставке.
Чтобы изобразить миграцию BTSC вдоль градиента FBS, поместите пластину в систему визуализации живых клеток и настройте программное обеспечение для автоматической визуализации на получение микроскопических изображений пластины каждые 1–2 часа в течение 72 часов. Когда получение изображения будет завершено, выберите новое определение обработки, чтобы отличить BTSC от вставленных ими пор на нижней стороне мембраны, изменив анализ, если он не позволяет точно отличить клетки от фоновой мембраны по мере необходимости.
Чтобы количественно оценить клетки, которые мигрировали через поры, соберите данные в виде площади поверхности клетки на нижней стороне мембраны для каждой из трех реплицируемых лунок для каждого условия. Затем изобразите на графике миграцию клеток по мере того, как площадь миграции клеток в микрометрах в квадрате с течением времени.