Совместное культивирование клеток глиобластомы на структурированных нейронах: метод мониторинга миграции клеток глиобластомы на нейронах гиппокампа крысы in vitro

Глиобластома обладает стволовыми клетками, которые мигрируют по аксональным путям миелинизированных нейронов, чтобы проникнуть в отдаленные участки мозга. Чтобы повторить миграцию клеток глиобластомы или GBM на нейроны in vitro, начните с снятия стеклянного покровного стекла.

Активируйте покровное стекло с помощью кислородной плазмы и загрунтуйте его функционализирующим агентом. Такая обработка обеспечивает легкий доступ к химическим веществам на последующих этапах. Добавьте PEGylated раствор в покровное стекло и инкубируйте. Этот раствор покрывает покровное стекло, предотвращая адгезию нейронов в случайных местах.

Нанесите полимер фотоинициатора на покровное стекло и установите его в камеру визуализации. Поместите камеру на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Оказавшись внутри, ультрафиолетовое освещение активирует молекулы фотоинициатора локально в обозначенных областях, соответствующих предполагаемым микроструктурам.

Активированные молекулы фотоинициатора расщепляют нижележащий слой ПЭГ, генерируя желаемый рисунок. Теперь добавьте раствор ламинина и инкубируйте. Ламинин - гликопротеин - откладывается в определенных местах, где был удален слой ПЭГ. Засейте среду, содержащую нейроны гиппокампа крысы, на покровный лист.

Инкубируйте для обеспечения прилипания нейронов к покрытым ламинином массивам для получения покровных покрытий с микроструктурой нейронов. Нанесите суспензию флуоресцентно меченных GBM-клеток на микроструктурированные нейроны. Изображение, чтобы увидеть флуоресцентные клетки GBM, мигрирующие на нейронах.

Чтобы сделать подложку для микроструктурирования, обрабатывайте 18-миллиметровые круглые стеклянные покровные стекла воздушной или плазменной активацией в течение 5 минут перед помещением покровных стекол в эксикатор со 100 микролитрами 3-аминопропилтриэтоксисилана на 1 час. Затем инкубируйте раствор Peg-SVA в дозе 100 мг на миллилитр в течение 1 часа для осаждения геля. В конце инкубации добавьте 3 микролитра PLPP и 50 микролитров абсолютного этанола в центр предметного стекла и дождитесь полного высыхания.

Для микроструктурирования предметного стекла установите покровное стекло в камеру Лудина и поместите камеру на предметное столико микроскопа, оснащенного системой автофокусировки. После визуализации загрузите изображения с микрошаблонами в программное обеспечение. После автоматического секвенирования УФ-излучения с помощью пипетки тщательно промойте PLPP от покровного стекла с помощью PBS. Затем инкубируйте покровный лист с 50 микрограммами на миллилитр ламинина в течение 30 минут, после чего еще раз промойте PBS, как показано на рисунке.

Чтобы создать культуру нейронов гиппокампа эмбриональной крысы на микроузорчатых покровных стеклах, после последней промывки регидратируйте стеклянные стекла питательной средой для культуры нейрональных клеток. Высевайте 5 раз по 10 до четвертой крысы нейроны гиппокампа, подвешенные в нейробазальной среде, обогащенной 3% лошадиной сывороткой на квадратный сантиметр на каждый микроузорчатый покровный лист для 24-часовой инкубации в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Центрифугируйте диссоциированные клетки глиобластомы в течение 5 минут при 1000 об/мин и ресуспендируйте гранулу в среду для культуры клеток глиобластомы. Затем перенесите 1 умножить на 10 на треть клеток GBM на нейроны с микроструктурой.