Выделение и культивирование первичных перицитов головного мозга: процедура выделения и культивирования перицитов из капилляров головного мозга крупного рогатого скота без контаминации эндотелиальных клеток
JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 4:21 мин • July 8th, 2025
В центральной нервной системе перициты являются многофункциональными клетками, которые обволакивают эндотелиальные клетки, образующие внутреннюю клеточную выстилку капилляров. Перициты помогают регулировать кровоток и поддерживать гомеостаз мозга.
Чтобы выделить перициты, начните с забора замороженных капилляров головного мозга крупного рогатого скота во флаконе. После размораживания переложите содержимое в пробирку, содержащую нужную среду. Центрифуга для гранулирования капилляров. Удалите надосадочную жидкость, содержащую замораживающую среду. Ресуспендируйте капиллярную гранулу в среду и засейте суспензию в колбу с внеклеточным матриксом, покрытую белком.
Инкубируйте для того, чтобы капилляры прилипли к покрытию в колбе. Замените среду на гепаринсодержащую среду. В культуре белковая оболочка внеклеточного матрикса способствует миграции перицитов от фрагментов капилляров и пролиферации, в то время как гепарин стимулирует миграцию эндотелиальных клеток.
Замените отработанные среды на гепаринсодержащие среды. Со временем перициты проецируют удлиненные отростки, которые прочно прилипают к колбе. При ограниченном пространстве субстрата эндотелиальные клетки пролиферируют и образуют контактно-ингибируемый монослой. По достижении соответствующей плотности перицитов удалите среду и промойте колбу с буфером.
Используйте трипсин-ЭДТА для отделения слабо связанных эндотелиальных клеток от колбы. Впоследствии добавьте среду для нейтрализации активности трипсина-ЭДТА. Промывайте средством несколько раз, чтобы удалить оторвавшиеся эндотелиальные клетки. Добавьте среду и следите за тем, чтобы перициты оставались прикрепленными к колбе. Инкубируйте обогащенную перицитами культуру для размножения.
Начните с размораживания одного флакона капилляров на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Как только капилляры оттают, переложите их в центрифужную пробирку с 30 миллилитрами DMEM-comp и центрифугируйте в течение 5 минут при 500 x g. Затем удалите среду из пробирки и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежего DMEM-comp. Переложите суспензию в колбу T75 с покрытием и дайте капиллярам прилипнуть ко дну в течение 4-6 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, снабженном 10% углекислым газом. После инкубации осмотрите колбу под световым микроскопом.
Фракции капилляров теперь должны быть прикреплены к дну колбы. На 4 день, после посева капилляров, осмотрите их под микроскопом, чтобы убедиться, что они сливаются примерно на 60-70%. Отсадите среду и аккуратно промойте клетки PBS. Добавьте 2 миллилитра размороженного Трипсина-ЭДТА и оставьте колбу в инкубаторе на 1-3 минуты, часто вынимая колбу и наблюдая за отслоением клеток с помощью микроскопа. Когда эндотелиальные клетки начнут округляться, осторожно постучите по колбе, чтобы отделить их.
Когда клетки отсоединились, прекратите трипсинизацию, добавив в колбу 10 миллилитров DMEM-комп. Промойте колбу несколько раз средой и аспирируйте суспензию эндотелиальных клеток, которую теперь можно использовать для других целей. Добавьте в колбу 10 миллилитров DMEM-comp и проверьте ее под световым микроскопом, чтобы убедиться, что перициты все еще присутствуют и прикреплены к дну. Затем поместите колбу обратно в инкубатор, чтобы дать возможность культуре, обогащенной перицитами, вырасти.
Обзор
В данной статье рассматриваются вопросы выделения и культивирования перицитов из капилляров головного мозга быка. Перициты играют важную роль в регуляции кровотока и поддержании гомеостаза головного мозга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология сосудов
Теоретические сведения
- Перициты представляют собой многофункциональные клетки центральной нервной системы.
- Они окружают эндотелиальные клетки капилляров.
- Перициты участвуют в регуляции кровотока.
- Они способствуют поддержанию гомеостаза мозга.
Цель исследования
- Выделение перицитов из капилляров головного мозга быка.
- Культивирование перицитов для дальнейших исследований.
- Изучение их роли в биологии сосудов.
Используемые методы
- Размораживание замороженных капилляров головного мозга быка.
- Центрифугирование для осаждения капилляров.
- Ресуспендирование в среде и посев в колбы.
- Использование среды, содержащей гепарин, для стимуляции миграции клеток.
Основные результаты
- Перициты мигрировали от фрагментов капилляров в культуре.
- Эндотелиальные клетки образовали контактно-ингибированный монослой.
- Перициты сформировали удлиненные отростки и прочно прикрепились к колбе.
- Успешное открепление эндотелиальных клеток без воздействия на перициты.
Выводы
- Данный метод позволяет эффективно изолировать и культивировать перициты.
- Обогащение популяции перицитов возможно при сохранении их адгезии.
- Эта методика может быть использована в дальнейших исследованиях функций перицитов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Надежное выделение и культивирование первичных перицитов головного мозга без загрязнения эндотелиальными клетками отвечает критической потребности в создании релевантных моделям заболеваний систем in vitro для нейроваскулярных исследований. Эта возможность повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и валидации мишеней при разработке лекарственных препаратов для ЦНС. Данный метод обеспечивает трансляционную преемственность, позволяя проводить механистические исследования функций перицитов и нейроваскулярных взаимодействий.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать специфические для перицитов пути в нейроваскулярной биологии.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем получения чистых культур перицитов.
- Способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез для ЦНС.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных культур перицитов для разработки количественного анализа.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет устранения влияния эндотелиальных клеток.
- Позволяет проводить стандартизированный скрининг соединений, влияющих на биологию перицитов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Поддерживает разработку релевантных для заболеваний моделей in vitro для изучения нейроваскулярных расстройств.
- Позволяет привести доклинические исследования в соответствие с биологией ЦНС человека за счет использования первичных клеток.
- Способствует продвижению нейроваскулярных мишеней с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод выделения перицитов применим на этапе перехода от первичного поиска к разработке доклинических моделей, создавая основу для последующего скрининга и изучения механизмов.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о функциях перицитов и нейроваскулярных механизмах.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые культуры перицитов без примеси эндотелия для проведения анализов.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение специфических ответов и фенотипов перицитов.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты in vitro с доклиническими нейроваскулярными моделями.
- Корпоративное использование: Устанавливает универсальный рабочий процесс изоляции клеток ЦНС для различных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в исследованиях ЦНС.
- Операционная ценность: Стандартизирует выделение и культивирование перицитов для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) нейроваскулярных мишеней и путей.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию программ по поиску новых лекарственных средств для ЦНС с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в методах выделения и культивирования первичных клеток.
- Необходим доступ к специализированным средам, покрытым колбам и микроскопии для идентификации клеток.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения чистоты и воспроизводимости.
- При необходимости может потребоваться адаптация для других видов или областей ЦНС.
- Результат зависит от наличия высококачественных капилляров головного мозга быка.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц
Похожие видео
0 Просмотры
Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo
Похожие видео
0 Просмотры
Клеточная система тройной культуры, моделирующая гематоэнцефалический барьер человека
Похожие видео
0 Просмотры
Очищение капилляров от свиного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культивирование перицитов головного мозга мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение Первичная мышиный Brain Микрососудистой эндотелиальных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция мозгового капилляров из ткани свежий человеческого мозга
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция и очищение моринских кардиологических перицитов
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026