Выделение церебральных капилляров из мозга человека: оптимизированный метод извлечения церебральных капилляров из ткани мозга человека

Церебральные капилляры являются жизненно важным компонентом гематоэнцефалического барьера – полупроницаемого барьера, обеспечивающего избирательное перемещение растворенных веществ между кровью и мозгом. Чтобы изолировать церебральные капилляры, начните со свежей ткани мозга человека. Удалите мозговые оболочки и обрежьте белое вещество.

Измельчите мозговую ткань на более мелкие фрагменты. Перенесите фрагменты в гомогенизатор, содержащий подходящий буфер, и гомогенизируйте. Гомогенизация разрушает ткани, высвобождая капилляры и остатки тканей в раствор.

Перелейте гомогенат в свежую пробирку и добавьте оптимальный объем подходящей среды с градиентом плотности. Центрифугируйте раствор для гранулирования капилляров. Слишком большая или слишком малая среда градиента плотности приводит к низкому выходу капилляров. Удалите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте гранулу в бычьем сывороточном альбумине или буфере с добавлением БСА. БСА стабилизирует пищеварительные ферменты и поддерживает структурную целостность капилляров. Далее отфильтруйте раствор с помощью соответствующего фильтра, чтобы удалить крупные сосуды и остатки тканей.

Затем пропустите фильтрат через фильтр с меньшей сеткой. Этот фильтр удерживает церебральные капилляры и пропускает через них более мелкие остатки и эритроциты. Затем переверните фильтр и смойте капилляры в свежей пробирке с буфером, дополненным BSA.

Центрифугируйте раствор и удалите надосадочную жидкость. Суспендируйте чистые капилляры в буфере и сохраните их для дальнейшего использования.

Для начала этой процедуры документально задокументируйте вес тканей мозга человека, который должен составлять около 10 граммов. Под микроскопом аккуратно извлеките все мозговые оболочки щипцами, а с помощью скальпеля срезайте белое вещество. Затем аккуратно разрежьте мозговую ткань и измельчите ее скальпелем в течение примерно 5 минут.

Перенесите мозговую ткань в тканевую мельницу и добавьте 30 миллилитров изоляционного буфера. Затем гомогенизируйте каждый образец с помощью 100 ударов при 50 об/мин. Не втягивайте воздух во избежание образования пузырьков. Запишите время каждые 25 ударов и общее время, необходимое для 100 ударов. После этого переложите гомогенат в гомогенизатор Dounce на льду. Гомогенизируйте суспензию примерно на 20 ходов и избегайте образования пузырей.

Затем равномерно распределите гомогенат мозга по четырем 50-миллилитровым центрифужным пробиркам и задокументируйте общий объем гомогената. Убедитесь, что вы добавили правильный объем Ficoll. Слишком малое или слишком большое количество Ficoll приведет к неправильной плотности для отделения капилляров от клеточного мусора и, таким образом, уменьшит количество капиллярных гранул и ограничит выход.

Используйте 10 миллилитров изоляционного буфера, чтобы промыть пестик и гомогенизатор и распределить его по четырем центрифугирующим пробиркам. Затем распределите 50 миллилитров буфера градиента плотности по центрифужным пробиркам. Плотно закройте пробирки центрифуги крышками. После этого смешайте гомогенат, среду с градиентом плотности и буферизируйте, энергично встряхивая пробирки. Центрифугируйте при давлении 5 800 x g в течение 15 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Впоследствии выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 2 миллилитрах 1% БСА.

После повторного взвешивания гранулы отфильтруйте суспензию через ячейку 300 микрометров. Капилляры фильтруются через сетку, в то время как более крупные сосуды и более крупные мозговые остатки остаются на сетке. Тщательно промойте сетку до 50 миллилитров 1% BSA, затем выбросьте сетку. Чтобы отделить капилляры от эритроцитов и других остатков мозга, распределите фильтрат капилляров по фильтрам клеточных штаммов толщиной 530 микрометров.

Капилляры удерживаются этим фильтром, в то время как эритроциты, другие одиночные клетки и мелкие остатки мозга проходят через фильтр и собираются в фильтрате. Далее промойте каждый фильтр 25 миллилитрами 1% BSA. Вылейте все фильтраты через шестой фильтр для увеличения выхода. Промойте каждый фильтр 50 миллилитрами 1% BSA. Оставьте клеточный штамм фильтром, содержащим капилляры, и выбросьте фильтрат. Затем переверните фильтры вверх дном и промойте капилляры с 50 миллилитрами 1% BSA в 50-миллилитровые пробирки.

Аккуратно надавите на наконечник пипетки и переместите его по фильтру, чтобы смыть капилляры мозга. Обязательно смойте все капилляры мозга, особенно с края фильтра. Избегайте образования пузырьков, так как это затрудняет процесс фильтрации и увеличивает вероятность потери капилляров. После сбора капилляров центрифугируйте все образцы при давлении 1500 x g в течение 3 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу примерно в 3 миллилитрах изоляционного буфера.

Затем соедините все ресуспендированные гранулы из одного образца в 15-миллилитровую коническую пробирку и заполните ее изоляционным буфером. Снова центрифугируйте при 1 500 х г в течение 3 минут при 4 градусах Цельсия и промойте еще два раза. Задокументируйте чистоту капилляров с помощью микроскопа при 100-кратном увеличении и камеры. Изолированные капилляры мозга теперь могут быть использованы для экспериментов, обработаны или подвергнуты мгновенной заморозке и хранению при температуре минус 80 градусов Цельсия в криопробирках в течение как минимум 6-12 месяцев.