Флуоресцентная пептидная зимография: модифицированная методика определения активности протеазы с использованием флуорогенных субстратов в гелях зимограммы

Зимография — это электрофоретический метод, в котором используется белковый субстрат, сополимеризованный полиакриламидным гелем, для обнаружения гидролитических ферментов и их активности. Для начала растворите образцы в зимографическом буфере, содержащем глицерин, додецилсульфат натрия или SDS и бромфеноловый синий.

Глицерин делает буфер образца более плотным, чем окружающий рабочий буфер геля, что позволяет легко загружать его в карманы геля. SDS - анионное моющее средство - денатурирует ферменты в образце и покрывает их отрицательным зарядом. Бромфенол синий - краситель для слежения - помогает контролировать прогресс образца в геле.

Загрузите образцы в полиакриламидный гель со встроенными флуорогенными подложками для определения активности протеазы. Теперь подключите электроды и начните электрофорез. Генерируемое электрическое поле заставляет все ферменты, связанные с SDS, мигрировать через гель к положительно заряженному электроду.

После завершения электрофореза удалите гель и промойте его в ренатурирующем буфере, содержащем неионогенное моющее средство, которое вытесняет SDS, обеспечивая ферментативную ренатурацию. Затем инкубируйте гель в развивающемся буфере, содержащем двухв