Флуоресцентная пептидная зимография: модифицированная методика определения активности протеазы с использованием флуорогенных субстратов в гелях зимограммы

Зимография — это электрофоретический метод, в котором используется белковый субстрат, сополимеризованный полиакриламидным гелем, для обнаружения гидролитических ферментов и их активности. Для начала растворите образцы в зимографическом буфере, содержащем глицерин, додецилсульфат натрия или SDS и бромфеноловый синий.

Глицерин делает буфер образца более плотным, чем окружающий рабочий буфер геля, что позволяет легко загружать его в карманы геля. SDS - анионное моющее средство - денатурирует ферменты в образце и покрывает их отрицательным зарядом. Бромфенол синий - краситель для слежения - помогает контролировать прогресс образца в геле.

Загрузите образцы в полиакриламидный гель со встроенными флуорогенными подложками для определения активности протеазы. Теперь подключите электроды и начните электрофорез. Генерируемое электрическое поле заставляет все ферменты, связанные с SDS, мигрировать через гель к положительно заряженному электроду.

После завершения электрофореза удалите гель и промойте его в ренатурирующем буфере, содержащем неионогенное моющее средство, которое вытесняет SDS, обеспечивая ферментативную ренатурацию. Затем инкубируйте гель в развивающемся буфере, содержащем двухвалентные катионы, которые активируют ферменты в геле.

Активные протеазы расщепляют флуорогенные субстраты, вызывая увеличение флуоресценции. Визуализируйте гель, чтобы наблюдать за флуоресцентными белковыми полосами, интенсивность которых пропорциональна активности протеазы.

Для начала растворите образцы в обычном буфере для образцов для зимографии. Добавьте в гелевый аппарат 400 миллилитров 1x Трис-Глицина SDS бегового буфера. Загружайте до 35 микролитров образца в одну лунку. Проведите испытания образцов при напряжении 120 вольт при 4 градусах Цельсия в течение 1,5 часов или до тех пор, пока стандарты молекулярной массы не покажут, что интересующие протеазы находятся в слое пептидного геля. После этого извлеките гели из пластиковой кассеты.

Промойте гели три раза в ренатурирующем буфере при комнатной температуре при слабом перемешивании, при этом каждое умывание длится 10 минут. Переложите гели в проявочный буферный раствор на 15 минут. Затем замените раствор свежим проявляющим буфером и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании в течение 24 часов. После этого используйте флуоресцентный гелевый сканер/имидж-сканер с соответствующими фильтрами возбуждения и излучения для отображения гелей.