Внутриутробная электропорация на основе доставки генов: метод введения плазмидной ДНК в эмбриональные клетки мозжечка мышиных эмбрионов

Начните с того, что возьмите беременную мышь под наркозом в положение лежа на спине. Подготовьте мышь, удалив волосы в области живота. Разрежьте кожу и нижележащие мышечные слои, чтобы обнажить рога матки - места, где находятся жизнеспособные эмбрионы.

Теперь вытяните рога матки из брюшной полости. Возьмите острый наконечник стеклянного капилляра, содержащего нужный раствор плазмиды ДНК. Найдите мозг эмбриона и введите раствор плазмидной ДНК через стенку матки в четвертый желудочек. Это положение находится перед мозжечковым зачатком - желаемым местом для возможной доставки ДНК.

После инъекции втяните пустой капилляр. Затем, для электропорации ДНК введенного эмбриона, расположите два электрода над стенкой матки таким образом, чтобы положительный электрод покрывал зачаток мозжечка, а отрицательный — область вокруг ушей.

Применяйте электрические импульсы в течение нужной длительности. Эти импульсы делают нейронные клетки мозжечка проницаемыми, позволяя плазмидной ДНК проникать в клетки-мишени. Наконец, поместите рога матки обратно в брюшную полость в их естественное положение. Зашите порезы, перенесите мышь в клетку и дайте ей восстановиться.

Начните с загрузки капилляра из боросиликатного стекла в пуллер для микропипеток и потяните, чтобы получить тонкий наконечник. Пометьте кончик капилляра черными чернилами для лучшей визуализации во время инъекции и нарисуйте на стекле шкалу. Работая под стереомикроскопом, используйте линейку и острый игольчатый пинцет, чтобы обрезать кончик до длины около 6 миллиметров и создать острый, односторонний скошенный край.

Отфильтруйте 1% стоковый раствор Fast Green через фильтр толщиной 0,22 микрона, чтобы удалить частицы красителя из раствора. Смешайте однонаправляющие РНК-плазмиды в равных частях с репортерной плазмидой люциферазы до конечной концентрации не менее 1 мкг на миллилитр для каждой плазмиды.

Окрасьте плазменный раствор Fast Green до конечной концентрации 0,05%. После обезболивания беременной мыши CD-1 изофлураном положите мышь на спину на грелку и введите обезболивающее. Наносите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость глаз во время операции. Зафиксируйте конечности скотчем и простерилизуйте брюшную полость дезинфицирующим средством.

Накройте мышь марлей, оставив открытой только операционную область. После того, как вы сделаете разрез кожи длиной около 2 сантиметров, найдите белую линию и с помощью ножниц с тупым концом ткани сделайте второй разрез немного меньшего размера через брюшину. Смочите вскрытую брюшную полость предварительно подогретым стерильным ПБС.

Далее с помощью кольцевых щипцов аккуратно извлекают рога матки из брюшной полости. Возьмитесь за стенку матки в промежутке между желточными мешочками двух соседних эмбрионов и слегка потяните. Избегайте любого давления на эмбрион во время протягивания его через разрез. После извлечения рогов матки аспирируйте примерно от 10 до 15 микролитров цветного раствора плазмиды с подготовленным стеклянным капилляром. Избегайте попадания пузырьков воздуха во время этого процесса.

Аккуратно удерживайте эмбрион кольцевыми щипцами и найдите область шеи. Медленно проникайте в дорсальный задний мозг кончиком стеклянного капилляра и продвигайтесь в четвертый желудочек. Введите около 1 микролитра плазмидной смеси. Подтвердите, что окрашенная ДНК не утекла из мозга и видна в виде ромбовидной структуры.

Здесь наиболее важно заполнить всю область четвертого желудочка плазмидным раствором, чтобы доставить ДНК также в дистальную часть зачатка мозжечка. В то же время убедитесь, что во время этого процесса не возникает кровотечения.

Поместите платиновый пинцет с электродными пластинами диаметром 5 мм латерально над головой эмбриона так, чтобы отрицательный полюс закрывал ухо, а положительный полюс располагался в мозжечковом зачатке над стенкой матки, и подайте электрические квадратные импульсы.

Когда все эмбрионы будут подвергнуты электропоре, осторожно поместите рога матки обратно в брюшную полость и заполните стерильным PBS. Дайте маточному рогу сместиться в естественное положение. Выключите анестезию и поместите животное животом вниз в новую клетку для восстановления.