Модель периневральной инвазии или ПНИ мышиного седалищного нерва: извлечение и обработка седалищного нерва для понимания инвазии раковых клеток

Раковые клетки могут перемещаться из места своего происхождения и проникать в окружающие нервы в процессе, называемом периневральной инвазией или ПНИ. ПНИ наблюдается на животной модели путем введения раковых клеток в основной нерв, такой как седалищный нерв, который затем извлекается для изучения степени инвазии.

Для начала подготовьте усыпленную мышь, которой ранее ввели раковые клетки в положении лежа. Снимите швы с задней конечности - места инъекции опухолевых клеток, чтобы обнажить седалищный нерв, который иннервирует мышцы задней конечности.

Используйте ножницы, чтобы разделить мышцы и обнажить нижележащий седалищный нерв. Рассеките нервные окончания, чтобы изолировать их от организма. Теперь используйте штангенциркуль для измерения и записи макроскопической степени инвазии раковых клеток.

Затем поместите рассеченный нерв в среду для наращивания, чтобы обеспечить подготовку образца при низких температурах. С помощью микротома криостата отрежьте тонкие срезы вложенного нерва и поместите их на предметное стекло. Окрасьте предметное стекло гистологическим красителем с гематоксилин-эозином.

Гематоксилин - основной краситель - окрашивает кислотные компоненты, такие как ядра, в то время как эозин - кислотный краситель - окрашивает основные компоненты, такие как цитоплазма. Понаблюдайте за предметным стеклом под микроскопом, чтобы измерить длину и площадь нейронной инвазии.

На 7-е сутки после операции положите усыпленную мышь на вентральную сторону и стабилизируйте дистальные отделы конечностей с помощью штифтов. После удаления кожи на тыльной стороне инъецируемой конечности и туловища используйте тупое рассечение, чтобы обнажить седалищный нерв вглубь мышц

.

Чтобы получить доступ к нерву в области спинного мозга, разделите подвздошную кость и крестец, вставив закрытые ножницы в узкую область, где расположен седалищный нерв, затем откройте ножницы, держа мышь. Осторожно рассеките седалищный нерв дистально до конца бедренной кости и проксимально к спинному мозгу.

Осторожное обращение имеет важное значение, так как поврежденные нервы чрезвычайно хрупки и склонны к разрыву при напряжении или сильном обращении. Будьте деликатными и сохраняйте целостность седалищного нерва во время рассечения.

Извлеките нерв, предварительно разрезав его дистальный конец. Осторожно приподнимите нерв, освобождая его от прилегающих тканей. Перережьте нерв на проксимальном конце как можно ближе к его выходу из позвоночного столба. Используйте штангенциркуль для оценки общей длины вторжения. Начните обработку с введения рассеченного нерва в соединение ОКТ. Расположите нервы в продольном направлении и как можно ровнее на дне формы.

Укажите на кассете проксимальную и дистальную сторону нерва, отметив буквами P и D. Затем поместите встроенные нервы поверх сухого льда. Срезы образцов с помощью микротома Cryostat на толщину 5 микрон и размещение срезов на стеклянных предметных стеклах. По возможности установите два нервных среза на предметное стекло. Укажите проксимальную сторону нерва. После окрашивания предметных стекол с помощью H&E и получения изображений с помощью сканера предметных стекол используйте программное обеспечение для обработки изображений для количественной оценки длины инвазии.