Индукция глиобластомы с использованием SB-опосредованной транспозиции: метод создания новой модели мыши с использованием транспозон-опосредованной интеграции SB-плазмиды в мозг неонатальной мыши

Начните с приема пробирки, содержащей смесь плазмид. Плазмида транспозона «спящая красавица» или транспозона SB спроектирована таким образом, чтобы нести переносимый элемент, содержащий онкоген человеческого происхождения, вызывающий глиобластому, зажатый между двумя инвертированными повторяющимися последовательностями. Кроме того, эта смесь содержит плазмиду транспозазы SB, которая содержит элемент, экспрессирующий фермент транспозазу.

Теперь добавьте в пробирку подходящий реагент для трансфекции. Аспирируйте инъекционную смесь в шприц, оснащенный микроиглой. Затем закрепите щенка мыши, находящегося под наркозом, в положении лежа на стереотаксической раме. Визуализируйте область головы щенка, чтобы найти черепные швы. Расположите микроиглу над черепными швами.

Введите смесь в боковой желудочек - полость внутри паренхимы мозга. Впоследствии раствор диспергируется в паренхиме головного мозга, где молекулы трансфекционного реагента облегчают проникновение плазмид внутрь клеток. Оказавшись внутри клетки, плазмида транспозазы экспрессирует молекулы фермента транспозазы, которые распознают инвертированные повторяющиеся последовательности и вырезают элемент транспозона.

Затем перемещаемый элемент ДНК реинтегрируется в область ТА-повтора геномной ДНК детеныша. Генетическая транспозиция приводит к онкогенной трансформации клеток мозга, что приводит к развитию глиобластомы в мозге мыши.

За 3-4 недели до эксперимента установите клетку для разведения мышей с одним самцом и одной самкой. Включите в комплект цветное пластиковое иглу, чтобы обогатить окружающую среду и увеличить шансы на спаривание. Удалите самца, как только беременность будет подтверждена, и через 18 дней после дня спаривания начните наблюдение за самкой для родов. Убедитесь, что суррогатная мать доступна примерно во время родов.

В первый послеродовой день выполните внутрижелудочковые инъекции. Приготовьте раствор для инъекций, предварительно аликвотировав 20 микролитров смеси ДНК, содержащей транспозонные плазмиды, в конечной концентрации 0,5 микрограмма ДНК на микролитр. Затем добавьте в раствор ДНК 20-микролитровую аликвоту раствора PEI и дайте им поинкубироваться при комнатной температуре от 20 минут до часа, после чего смесь следует хранить на льду.

Для инъекционной иглы прикрепите шприц объемом 10 микролитров к игле для подкожных инъекций 30-го калибра, скошенной под углом 12,5 градусов. Затем присоедините шприц к насосу с автоматическим впрыском. Протестируйте установку с 10 микролитрами воды и обязательно опорожните шприц. Теперь охладите неонатальную стереотаксическую стадию с помощью суспензии из сухого льда и алкоголя. Когда он остынет до 2-8 градусов по Цельсию, приступайте к инъекциям.

Обезболите щенка, положив его на лед на 2 минуты. Пока щенок находится на льду, загрузите в шприц раствор для инъекций. После обезболивания перенесите щенка в раму и обездвижьте его голову между покрытыми марлей ушными планками. Убедитесь, что спинная сторона черепа горизонтальна и параллельна поверхности каркаса. Кроме того, черепные швы должны быть хорошо видны.

Если голова щенка не обездвижена достаточно прочно, она будет двигаться во время инъекции, в то время как если она слишком сильно зажата между ушными стержнями каркаса, лямбда не будет видна, и давление внутри головы заставит введенный раствор вытечь наружу.

Крепко схватив щенка за раму, протрите голову 70% этанолом. Затем опустите иглу и отрегулируйте ее положение так, чтобы она соприкасалась с лямбдой. Далее поднимите иглу и переместите ее на 0,8 миллиметра в сторону и на 1,5 миллиметра рострально. Затем снова опустите его, пока на коже не появятся небольшие ямочки. Запишите координаты этого положения. Затем опустите иглу на 1,5 миллиметра через кожу и череп в кору у бокового желудочка.

Туда введите 0,75 микролитра в течение 90 секунд и подождите минуту, чтобы раствор рассеялся. Во время ожидания следующий щенок, которому будет сделана инъекция, может быть обезболиван. После ожидания медленно поднимите иглу. Затем перенесите щенка в место восстановления под нагревательной лампой. Время от обезболивания до прогревания должно быть менее 10 минут; Чем быстрее, тем лучше.

Следите за его дыханием, и при необходимости аккуратно растирайте конечности, чтобы стимулировать дыхание. Как только щенок согреется, приобретет розовый цвет и ровное дыхание, верните его матери.