Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:33 мин. • July 8th, 2025
Синаптосомы представляют собой изолированные нейронные фракции, богатые синаптическими везикулами. Эти синаптосомы поглощаются астроцитами — популяцией иммунных клеток в мозге — в результате процесса, известного как фагоцитоз.
Для изучения астроцитарно-опосредованного фагоцитоза in vitro начните с взятия культурального планшета, содержащего монослой астроцитов. Теперь добавьте в пластину суспензию конъюгированной синаптосомы с индикатором pH. Этот индикаторный краситель обладает свойством флуоресцировать исключительно при низком pH. Инкубируйте тарелку в течение желаемого времени.
Во время инкубации фосфатидилсерин или ФС, присутствующий на внешней мембране синаптосомы, позволяет ему связываться с соответствующими рецепторами ФС на мембране астроцитов. Это способствует расселению синаптосом в основании. Отсасывайте отработанную среду вместе с несвязанными синаптосомами из пластины.
Далее дополните тарелку факторами, способствующими фагоцитозу, и инкубируйте. Затем визуализируйте пластину с помощью флуоресцентного микроскопа. Связываясь с поверхностью, астроциты поглощают синаптосомы, заставляя их проникать в фагосомы. Попадая внутрь фагосом, низкий pH заставляет молекулы индикаторного красителя ярко флуоресцировать.
Визуализация в режиме реального времени показывает наличие ярких флуоресцентных пятен, соответствующих индикатору pH, конъюгированных синаптосом, поглощенных астроцитами. В конце концов, эти пятна исчезают, что свидетельствует об успешной деградации синаптосом.
Для визуализации поглощения синаптосомы в реальном времени, во-первых, удалите надосадочную жидкость из каждой лунки сливающейся культуры астроцитов и быстро промойте клетки три раза 1 миллилитром DPBS на промывку. После последнего промывания добавьте 300 микролитров иммунопанированной основной среды астроцитов и 5 микролитров индикатора pH – конъюгированных синаптосом, а также любые дополнительные факторы, которые могут модулировать фагоцитоз глиальных клеток.
Позвольте синаптосомам осесть на дно лунок и прикрепиться к рецепторам фосфатидилсерина на астроцитах при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Через 40 минут выбросьте надосадочную жидкость и быстро, но аккуратно промойте лунки три раза 1 миллилитром DPBS на одну промывку.
После последней промывки добавьте 500 микролитров свежей среды, дополненной интересующими факторами, в соответствующие лунки и перенесите пластину на живой прибор для визуализации. Выберите положения изображения, отрегулируйте фокусировку, время экспозиции, яркость и мощность светодиодов, а также установите формат изображения, временной интервал и общее количество циклов для изображения в реальном времени в соответствии с экспериментами. Затем начните визуализацию экспериментов по фагоцитозу в реальном времени.