Ex vivo электропорация срезов мозжечка куриного эмбриона: метод введения плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, для визуализации зернистого развития клеток

Гранулярные клетки мозжечка являются наиболее распространенным типом нейронов мозга. Внешний зернистый слой, EGL, состоит исключительно из гранулярных клеточных предшественников, GCP, которые дифференцируются и мигрируют внутрь, образуя внутренний зернистый слой, IGL.

Чтобы визуализировать развитие зернистых ячеек, подготовьте камеру электропорации, прикрепив анод к основанию чашки Петри. Добавьте питательную среду, чтобы покрыть электрод. Теперь поместите культуральную вставку на электрод, покрытый средой. Перенесите срезы мозжечка куриного эмбриона на культуральную вставку в сагиттальной ориентации.

Сагиттальная плоскость позволяет идентифицировать целевой слой-EGL на фоне различных слоев мозжечка. Добавьте вязкий раствор красителя, содержащий плазмидную ДНК GFP, поверх EGL. Плазмидная ДНК GFP кодирует зеленый флуоресцентный белок, который равномерно распределяется в цитоплазме клетки и позволяет визуализировать живые клетки.

Затем поместите катод в среду рядом с EGL, но не непосредственно на ткань. Затем подайте несколько электрических импульсов на разные области EGL. Электрические импульсы индуцируют временные поры в клеточной мембране, позволяя клеткам поглощать плазмидную ДНК. Впоследствии, плазмидная ДНК обеспечивает экспрессию GFP в гранулярных клетках.

Визуализируйте срезы мозжечка под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать за гранулярной дифференцировкой клеток и характером миграции на разных стадиях развития клеток.

Соорудите камеру электропорации, закрепив анод электропоратора к основанию 60-миллиметровой чашки Петри с помощью изоляционной ленты. Добавьте примерно 1 миллилитр HBSS, чтобы покрыть электрод. Затем поместите культуральный вкладыш толщиной 0,4 микрометра поверх электрода, покрытого HBSS.

Используйте 3-миллилитровую пастеровскую пипетку с отрезанным наконечником для переноса идентифицированных ломтиков, до 5 на вкладыш для культуры. Затем отделите ломтики и дайте им осесть на культурную вставку в сагиттальной ориентации. С помощью пипетки удалите лишнюю среду из срезов мозга. Оставьте вставку на электроде так, чтобы между вставкой и электродом был контакт.

В этой конфигурации культуральная вставка со срезами будет опираться на поверхность среды, сохраняя контур, но обеспечивая пространственное нацеливание катода. С помощью наконечника для дозатора P10 нанесите 5 микролитров ДНК, разбавленной 20% Fast Green, на поверхность целевой области каждого среза. Добавление Fast Green гарантирует, что раствор ДНК будет достаточно вязким, чтобы предотвратить широкое рассеивание ДНК.

Затем поместите катод на желаемую целевую ткань и электропорируйте образцы. Избегайте прямого контакта катода с тканью, размещая катод как можно ближе к ткани, не касаясь ее. Повторите электропорацию в нескольких областях внешнего зернистого слоя на каждом отдельном срезе мозжечка по желанию.

Когда закончите, переложите вкладыш для культуры в 30-миллиметровую чашку Петри. К каждой культуре добавьте 1 миллилитр предварительно подогретой питательной среды под вкладыш для культур. Следите за тем, чтобы вставка не плавала на среде. Вкладыш для культуры должен соприкасаться со средой, но срезы не должны купаться в ней.