Электропорация одиночных клеток в органотипических культурах срезов мозга: метод in vitro для доставки плазмид внутрь целевых нейронов в срезах гиппокампа мозга

Начните электропорацию с взятия стеклянной пипетки, содержащей нужный раствор плазмиды. Прикрепите его к держателю для микропипетки с электродом из серебряной проволоки, убедившись, что электрод вставлен в микропипетку. Возьмем камеру для электропорации, содержащую ультратонкий участок гиппокампа, погруженный в искусственную спинномозговую жидкость.

Опустите заземляющий электрод в жидкость, присутствующую в камере, для последующей электропорации. Опустите наконечник пипетки в камеру электропорации и запишите базовое сопротивление. С помощью микроскопа расположите наконечник пипетки рядом с целевой клеткой. Как только пипетка вступает в контакт с мембраной нейрона, ее сопротивление резко возрастает.

Приложите положительное давление воздуха, чтобы создать небольшую инвагинацию в мембране нейронов. Быстро нанесите мягкое всасывание, чтобы протолкнуть мембрану вверх, создав неплотное уплотнение между наконечником пипетки и мембраной. Повторите этот процесс еще несколько раз, чтобы кондиционировать мембрану и избежать лизиса клеток.

После кондиционирования примените сильное всасывание, чтобы сформировать плотное уплотнение с мембраной, называемой гигаомным уплотнением. С помощью электрических импульсов формируют переходные поры в герметизированном участке мембраны. Эти отверстия облегчают проникновение плазмид внутрь целевого нейрона. После электропорации поры снова запечатываются, захватывая плазмиды внутри нейрона.

Для подготовки срезов культур к электропорации необходимо перенести интересующие культуральные вкладыши в индивидуальные 3-сантиметровые чашки Петри, загруженные 900 микролитрами питательной среды, и поместить культуры в настольный инкубатор с углекислым газом. Далее в чашке Петри диаметром 3,5 см предварительно инкубируют вкладыши свежих культур с 1 миллилитром питательной среды на вкладыш в течение 3,5 см и стерилизуют линии электропораторной установки 10% хлорным изветелем в течение 5 минут.

По окончании перфузии промойте линии ионизированной автоклавной водой в течение не менее 30 минут перед перфузией стерилизованным фильтром aCSF, содержащим 0,001 миллимолярного тетродотоксина. Установите импульс электропоратора на амплитуду минус 5 вольт, квадратный импульс, последовательность 500 миллисекунд, частоту 50 герц и ширину импульса 500 микросекунд. Наполните стеклянную пипетку 5 микролитрами раствора, содержащего плазмиды, и осторожно похлопайте по наконечнику несколько раз, чтобы удалить все захваченные пузырьки.

С помощью диссекционного микроскопа убедитесь, что наконечник не поврежден, и надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду. Когда наконечник соприкоснется с аCSF, запишите показания сопротивления пипетки электропоратора. Чтобы изолировать культуру среза, разрежьте мембрану вставки культуры острым лезвием и с помощью остроугольных щипцов аккуратно перенесите культуру среза в камеру электропорации. Затем зафиксируйте положение культуры с помощью анкера для ломтиков.

Для электропорации интересующих клеток приложите положительное давление к пипетке ртом и с помощью трехмерных регуляторов переместите наконечник пипетки к поверхности культуры среза. Рассматривая культуру под микроскопом, приближайтесь к клетке-мишени с помощью наконечника, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка. После визуализации ямочки быстро надавите ртом на умеренное отрицательное давление, чтобы между кончиком пипетки и плазматической мембраной образовалось рыхлое уплотнение.

Мембрана будет немного входить в пипетку. Следует наблюдать примерно 2,5-кратное увеличение начального сопротивления пипетки, о чем свидетельствует увеличение тона из динамиков. Быстро снова надавите на нее, чтобы ямочка восстановилась. Затем немедленно завершите еще как минимум два цикла давления, как только что было показано, без паузы. После последнего импульса давления удерживайте отрицательное давление в течение 1 секунды. Тембр из динамиков достигает стабильной вершины по высоте. Используйте ножную педаль для быстрого пульсирования электропоратора.

После электропорации осторожно втяните пипетку примерно на 100 микрон от ячейки, не оказывая давления, и снова приложите положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично базовому показанию, прежде чем приближаться к следующей ячейке. Когда все интересующие клетки будут подвергнуты электропоре, перенесите культуру среза в одну из подготовленных вставок для свежей культуры и поместите вкладыш при температуре 35 градусов Цельсия на срок до 3 дней.