Изоляция нейронов спинного мозга: процедура градиента плотности для изоляции нейронов спинного мозга новорожденных для исследований in vitro

Чтобы изолировать нейроны спинного мозга, возьмите позвоночный столб неонатальной мыши и поместите его на чашку Петри. Промойте позвоночный столб солевым раствором, чтобы освободить спинной мозг. Перенесите спинной мозг в холодную нейронную среду для повышения выживаемости клеток.

Далее измельчите спинной мозг и перенесите фрагменты в трубку, содержащую свежую нейронную среду. Инкубируйте трубку в шейкере на водяной бане для акклиматизации. После инкубации удалите отработанную среду и добавьте среду для пищеварения. Пищеварительные ферменты расщепляют тканевый матрикс, расслабляя клетки.

Выполните растирание, отсасывая фрагменты ткани в пипетку, и быстро опорожните компоненты, высвобождая отдельные клетки во взвешенном состоянии. Затем перенесите эту суспензию в пробирку, содержащую среду с градиентом плотности, и центрифугу.

После центрифугирования поверхностный слой пробирки содержит остатки ткани. Первый слой включает в себя олигодендроциты и астроциты. Второй и третий слои содержат нейроны, причем третий слой обладает наивысшей чистотой. Наконец, гранула содержит клетки микроглии.

Соберите третий слой в свежую пробирку и добавьте нейронную среду, чтобы разбавить среду градиента плотности. Центрифуга для гранулирования нейронов. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в нейробазальной среде, чтобы сохранить нейроны для дальнейших экспериментов.

Чтобы начать эту процедуру, отделите голову от тела усыпленных детенышей мыши с помощью ножниц. Далее стабилизируйте хвост и руки на процедурном столе тыльной стороной вверх. Затем срежьте кожу с помощью изогнутых ножниц по радужной оболочке. После этого разрежьте спинной мозг из поясничной области чуть выше бедер, а затем разрежьте грудную клетку с обеих сторон, чтобы отделить ее от тела.

Промойте образцы последовательно в трех 10-сантиметровых чашках Петри, содержащих 5 миллилитров стерилизованных PBS, в течение 10 секунд каждая, чтобы удалить лишнюю ткань. Затем введите иглу 22-го калибра и шприц, наполненный 5 миллилитрами стерилизованного PBS, в каудальный конец позвоночного столба и промывайте краниально, позволяя спинному мозгу выйти в четвертую чашку Петри.

Пересадите спинной мозг в 15-миллилитровой трубке с 5 миллилитрами HABG на лед. Избегайте раздавливания спинного мозга и повторите процедуры для остальных щенков. В идеале этот процесс должен занимать не более 30 минут, чтобы одна группа щенков могла обеспечить здоровую изоляцию нейронов.

Чтобы приготовить градиент плотности, подготовьте каждый из четырех слоев в четырех 15-миллилитровых тюбиках. Затем добавьте по 1 миллилитру каждого слоя в новую 15-миллилитровую трубку. Начните со слоя 1 внизу и добавляйте последовательно, пока не дойдете до слоя 4 вверху. Избегайте нарушения слоев во время добавления и любых энергичных движений, которые могут привести к смешиванию. Далее добавьте в измельченную ткань питательную среду. Поместите образец в шейкер на водяную баню при температуре 30 градусов Цельсия. После этого снимите салфетку с водяной бани и дайте ей отстояться в течение нескольких минут.

Для выполнения растирания необходимо аспирировать избыток пищеварительной среды. Суспензируйте ткань в 2 миллилитрах HABG. Используя узкокалиберный дозатор, растирайте 10 раз за 45 секунд и избегайте попадания воздуха, так как он значительно снизит жизнеспособный выход. Растирание является одним из самых важных этапов процедуры. Ткань должна быть осторожно втянута в отполированную пипеткой и опорожнена из нее, избегая чрезмерной энергии, которая может привести к гибели нейронов, или слишком бережного подхода, что приведет к низкому выходу.

После этого аспирируйте верхние 2 миллилитра надосадочной жидкости и переложите их в новую 15-миллилитровую пробирку с надписью «сбор». Повторите процедуры сбора еще два раза, чтобы получить 6 миллилитров надосадочной жидкости. Затем медленно перенесите содержимое сборной пробирки в подготовленную ранее градиентную пробирку, не допуская нарушения градиента.

Чтобы очистить нейроны, центрифугируйте градиентную трубку в течение 15 минут при температуре 800 x g и 22 градусах Цельсия. Соберите нужные слои и переложите их в новую 15-миллилитровую пробирку. Для выделения нейронов максимальной чистоты соберите слой 3. Для большего урожая с меньшей чистотой собирайте пласты от 2 до 3.

Далее разбавьте градиент плотности, добавив 5 миллилитров HABG к вновь собранным слоям. Центрифугируйте его при 200 х г в течение 2 минут при температуре 22 градуса Цельсия. Через 2 минуты выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клетки в 5 миллилитрах HABG, взмахнув гранулой. Затем снова центрифугируйте образец при 200 x g в течение 2 минут при 22 градусах Цельсия. Затем выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 3 миллилитрах нейробазальной среды, взмахнув гранулой.