JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 3:38 мин • July 8th, 2025
Дорсальная поверхность мышиного языка покрыта тремя основными видами выступающих выступов, называемых сосочками, а именно грибовидными, околоплодными и нитевидными сосочками. Околоплодные сосочки, или CVP, включающие эпителиальные углубления, в которых размещаются вкусовые рецепторы, поддерживаются слоем соединительной ткани - собственной пластинкой.
Чтобы изолировать эпителий CVP, начните с усыпленной мыши в положении лежа на спине. Затем надрежьте щеки и рассеките толстую полосу ткани - уздечку языка - чтобы отделить язык от дна ротовой полости. Переложите вырезанный язык в посуду с охлажденным буфером.
Далее вырезаем переднюю часть языка. Осторожно введите коктейль для пищеварения, содержащий ферменты диспазу и коллагеназу, в субэпителиальное пространство области CVP, между эпителием и нижележащими тканями. Втяните иглу во время введения суспензии в область.
Инкубируйте язык в течение соответствующего времени. Диспазы и коллагеназы переваривают белки внеклеточного матрикса в соединительной ткани, способствуя отделению эпителия CVP от ткани. После инкубации сделайте надрезы в эпителии в области ЦВП.
Аккуратно отделите разрыхленный эпителий от подлежащих тканей. Наконец, перенесите отделенный эпителий CVP в пробирку, покрытую белком, чтобы предотвратить прилипание ткани к стенке трубки. Эпителий CVP может быть сохранен для дальнейшей последующей обработки.
После усыпления взрослой мыши используйте большие стерильные ножницы для вскрытия, чтобы разрезать щеки и сломать челюсть. Затем поднимите язык и разрежьте уздечку языка, чтобы отделить язык от дна ротовой полости. Вырежьте язык и соберите его в стерильный ледяной dPBS с кальцием и магнием.
Под микроскопом удалите и выбросьте передний язык, разрезав лезвием бритвы только переднюю часть межкоренного возвышения. Затем с помощью деликатной рабочей жидкости удалите волосы и лишнюю жидкость с заднего языка.
Затем наполните шприц объемом 1 миллилитр 200-300 микролитрами раствора инъекционного фермента и вставьте иглу 30-го калибра диаметром 1/2 дюйма чуть выше межмолярного возвышения до внутренней части околоплодных сосочков или CVP. Введите ферментный раствор под и на боковые края CVP между эпителием и подлежащими тканями. Медленно и непрерывно извлекайте шприц из языка во время введения раствора.
Инкубируйте язык в стерильном dPBS без кальция и магния при комнатной температуре ровно 33 минуты. С помощью очень тонких ножниц для рассечения сделайте небольшие надрезы в эпителии с обеих сторон и непосредственно перед ЦВД. Затем аккуратно отшелушите эпителий, приподняв его тонкими щипцами. Как только траншейный эпителий освободится от подлежащей соединительной ткани, поместите его в микроцентрифужную пробирку объемом 2 миллилитра, предварительно покрытую FBS.