Введение микропузырьков в изолированные эмбрионы мышей: метод доставки микропузырьковых контрастных веществ в сосудистую сеть живых эмбрионов мышей

Для доставки микропузырьков начните с равномерной суспензии микропузырьков, нацеленных на эндотелиальные клетки, составляющих газообразное ядро в шприце, соединенном с трубкой.

Загрузите эту сборку в шприцевой насос и прикрепите к трубке стеклянную иглу. Теперь перенесите охлажденный эмбрион мыши, экспрессирующий специфические рецепторы эндотелиальных клеток, в чашку, помещенную на столик стереоскопа.

Аккуратно извлеките эмбрион из желточного мешка и околоплодных оболочек. Закрепите мешочек и края плаценты. Промойте эмбрион теплым буфером, чтобы восстановить его кровоток. Накройте эмбрион предварительно подогретым гелем для ультразвука для оптимальной передачи ультразвуковой волны. Дополняйте буфером для поддержания его физиологического состояния.

Осторожно введите суспензию микропузырьков с желаемой скоростью потока в подходящую вену на поверхности плодной оболочки плацентарного диска с помощью шприцевого насоса. Введенные микропузырьки проходят через кровоток и связываются со специфическими рецепторами на эндотелиальных клетках, выстилающих кровеносные сосуды.

Используйте ультразвуковой датчик для передачи высокочастотных ультразвуковых волн эмбриону. Сильно сжимаемые газовые ядра микропузырьков заставляют их колебаться нелинейно, рассеивая ультразвуковые волны с частотами, отличными от падающих волн. Эти сигналы и линейные сигналы ткани возвращаются к датчику.

Датчик передает их в систему визуализации, которая отличает рассеянные сигналы микропузырьков от сигналов тканей, создавая ультразвуковые изображения эмбриональных кровеносных сосудов с контрастным усилением.

Пипеткой наберите необходимый объем микропузырьков стокового раствора и добавьте в аликвоту физиологического раствора. Перемешайте, осторожно помешивая кончиком пипетки. Затем с помощью иглы 21-го калибра наберите разбавленный раствор микропузырьков в чистый шприц. После извлечения иглы удалите из шприца пузырьки воздуха и прикрепите люэр и трубку. Медленно протолкните раствор до конца трубки, следя за тем, чтобы в нем не образовывались пузырьки воздуха.

Наконец, вставьте шприц в шприцевой инфузионный насос для дозирования микропузырьков со скоростью 20 микролитров в минуту при общем объеме 20 микролитров. Прикрепите вытянутую стеклянную иглу к концу трубки. Переместите насос ближе к стадии впрыска. С помощью перфорированной ложки случайным образом выберите и выньте один эмбрион из охлажденной формы для фильтрующего материала. Поместите эмбрион в чашку для вскрытия, расположенную на ультразвуковом столике под стереоскопом.

Затем найдите ту сторону эмбриона, которая кажется наименее васкуляризированной. Это область с низкой васкуляризацией, обычно прилегающая к области головы. Затем с помощью тонких щипцов разрежьте или оторвите ровно столько желточного мешка и амниотических оболочек, сколько нужно, чтобы можно было удалить эмбрион изнутри, но не более. Затем аккуратно маневрируйте мешочком вокруг эмбриона. Затем расположите эмбрион на боку так, чтобы плацента и пупочные сосуды находились впереди.

Стабилизируйте диссекционную чашку с помощью небольших кусочков пластилина. С помощью четырех булавок от насекомых приколите желточный мешок и края плаценты, избегая крупных сосудов. С помощью шприца, содержащего предварительно нагретый до 45 градусов Цельсия PBS, промойте эмбрион до тех пор, пока не станет видно, как кровь течет в эмбрион. Пупочная артерия идентифицируется по пульсирующей, ярко-красной крови. Пупочная вена и связанная с ней сосудистая сеть имеют более темную кровь и обычно перекрывают кровь из пупочной артерии на плацентарной стороне.

На этом этапе расположите чашку так, чтобы инъекция могла быть выполнена с комфортом. Как только эмбрион оживет, покройте его, но не плаценту, предварительно подогретым гелем для ультразвука. С помощью тонких щипцов аккуратно удалите пузырьки воздуха вокруг эмбриона и долейте до чашки предварительно подогретый PBS. На протяжении всей процедуры следите за уровнем раствора в PBS и гелевых шприцах и при необходимости добавляйте резервные шприцы в нагревательный стакан.

Затем установите стеклянную иглу на большой шарик из пластилина на краю чашки для препарирования и вставьте конец иглы в PBS. Выбирайте вену на хорионической поверхности плацентарного диска как можно дальше от основной ветви. Затем с помощью ножниц обрежьте кончик иглы в соответствии с размером сосуда, разрезая кончик под небольшим углом. Используйте край пружинных ножниц, чтобы удалить зазубренные края стекла.

Теперь, используя шприцевой насос, медленно вводите раствор микропузырьков со скоростью 20 микролитров в минуту в стеклянную иглу до тех пор, пока весь воздух не будет вытеснен из кончика иглы и можно будет увидеть, как микропузырьки свободно поступают в PBS. Остановите насос и сбросьте его на объем впрыска 20 микролитров. Не допускайте попадания воздуха в иглу для инъекций, чтобы избежать попадания воздуха в сосудистую систему эмбриона.

Осторожно введите кончик стеклянной иглы в выбранную вену в плаценте и убедитесь, что она неподвижна. Откиньте головку стереоскопа и расположите ультразвуковой датчик так, чтобы эмбрион располагался равномерно между очагами на расстоянии от 6 до 10 миллиметров. Затем начните визуализацию и начните болюсную инъекцию микропузырьков. Через минуту, когда внедрение будет завершено, запустите таймер для этапа сбора данных.