Выделение комменсальных бактерий конъюнктивы на основе мазка: метод выделения комменсальных бактерий из конъюнктивы мышиной модели

Конъюнктива глаза содержит комменсальные бактерии. Эта местная микрофлора защищает глаза от инфекций, активируя иммунные клетки для атаки любых вредных микробов, которые попадают в слизистую оболочку глаз.

Чтобы изолировать комменсальные бактерии, поместите мышь, находящуюся под наркозом, в боковое положение. Возьмите стерильный тампон из глаз, смоченный в подходящей среде. Вставьте влажный кончик тампона в медиальную конъюнктивальную область левого глаза. Надавите на глазное яблоко и перемещайте тампон вперед и назад вдоль конъюнктивы, чтобы собрать разнообразную комменсальную популяцию.

Извлеките тампон и перемешайте его в пробирке, содержащей среду для обогащения микроорганизмов. На этом этапе захваченные бактерии из хлопковой сетки тампона высвобождаются в среду. Выбросьте тампон и инкубируйте трубку, чтобы способствовать началу роста бактерий.

Нанесите несколько капель мазка из глазного тампона с инокулированной обогащенной средой на кровяную агаровую пластину по нужной схеме и инкубируйте. Казеин и пептоны сои, присутствующие в среде, поставляют азот, необходимый для синтеза пептидов, в то время как хлорид натрия поддерживает осмотическое равновесие.

Комменсальные бактерии обладают ферментами гемолизина, которые переваривают гемоглобин, присутствующий в среде крови. Это создает характерный узор на агаровой пластине, заставляя различные бактерии размножаться в морфологически различные колонии. Посчитайте количество колоний, чтобы определить их относительную численность в конъюнктиве.

Убедитесь, что мышь правильно обезболивается, сдавливая заднюю подушечку лапы. Продолжайте движение только в том случае, если нет движения. Назначьте одну руку для работы с мышами под наркозом, а другую руку для работы с мазком из глаз и бактериологическим исследованием. Извлеките мышь из клетки и положите ее на верхнюю часть рабочей поверхности, расположенной на боку, с открытым левым глазом. Сбрызните руки в перчатках изопропанолом и высушите их бумажным полотенцем.

Откупорьте пробирку микроцентрифуги BHI с маркировкой специальной рукой для работы со средой и поместите пробирку обратно в штатив. Окуните покрытый ватой кончик тампона из глаз в BHI. Затем извлеките тампон из трубки, дважды вращая кончиком по внутренней трубке, чтобы удалить лишнюю жидкость и удалить ее.

Рукой для работы с мышью аккуратно держите мышь за загривок. Другой рукой приложите кончик тампона из глаза к медиальной конъюнктивальной области левого глаза. Слегка надавите на глазное яблоко и переместите тампон движением для промывания окна между нижним веком и глазом 10 раз, поддерживая постоянное давление. Не касаясь меха, аккуратно снимите кончик тампона перпендикулярно тому месту, куда он был введен. Поместите ватную сторону тампона вниз прямо в пробирку микроцентрифуги с маркировкой и средой BHI.

Нанесите глазную каплю на тампон из глаза. При желании приобретите тампоны из кожи или меха для контрольных образцов, соответствующим образом стерилизуя перчатки между каждым мазком. Когда закончите, верните мышь в клетку. Дайте тампону постоять на льду от 10 до 15 минут. Затем простерилизуйте руки в перчатках и удалите тампон, одновременно перемешивая наконечник в среде в течение 10 оборотов. Извлеките тампон, прижав кончик к внутренней стенке трубки на пять оборотов, и выбросьте его в контейнер для биологически опасных веществ. Повторите этот процесс для каждой мыши.

Обогатите образец, статически инкубируя пробирки в течение 1 часа при температуре 37 градусов Цельсия. Во время инкубации пометьте одну пластину TSA комнатной температуры на каждый тампон из глаза мыши или контрольный тампон и разделите его пополам. Извлеките обогащенные образцы из инкубатора и поместите их на лед. Кратковременно перемешайте образцы для смешивания. Затем нанесите 10 микролитров образца на планшет TSA и наклоните пластину, чтобы сформировать полоску. Повторите это дважды.

С другой стороны разделительной линии пластины создайте 10 точек по 10 микролитров образца каждая. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов, 2 дней и 4 дней в чистой камере, которая предотвращает высыхание агаровых пластин. Посчитайте колонии в полосах. Обратите внимание на морфологию и рассчитайте количество колониеобразующих единиц в мазке для морфологически сходных изолятов.