Изоляция интерстициальных клеток мышиного клапана: ферментативный метод выделения и культивирования ВИК из аортального клапана мыши

Аортальный клапан сердца представляет собой трехстворчатую структуру, состоящую из внутренних интерстициальных клеток клапана или ВИК, распределенных по плотному внеклеточному матриксу и вышележащим эндотелиальным клеткам клапана или ВЭК.

Чтобы изолировать ВИЦ, сначала подготовьте усыпленную мышь в лежачем положении. Через срединный разрез брюшной полости и грудной клетки обнажите сердце. Сделайте небольшую зазубрину между левым предсердием и желудочком с последующей перфузией физиологическим раствором для отвода крови. Разрежьте восходящую аорту на уровне дуги аорты и заберите сердце.

Пересеките и отбросьте дистальные две трети желудочков, а затем продольно рассеките оставшуюся часть сердца, чтобы выявить «U-образные» створки аортального клапана. Вырежьте листочки и промойте охлажденным буфером для удаления крови.

Впоследствии обработайте листочки низкоконцентрированным раствором коллагеназы и инкубируйте. В низких концентрациях коллагеназа - протеолитический фермент - лишь частично расщепляет внеклеточный матрикс, вытесняя поверхностные VECs из створок.

Центрифугируйте и замените содержащую фермент надосадочную жидкость буфером, переложив ресуспендированную гранулу в чашку Петри. Соберите листочки и обработайте их высококонцентрированным раствором коллагеназы для повторного пищеварения. После инкубации коллагеназа еще больше разрушает внеклеточный матрикс, высвобождая ВИК в раствор.

Центрифуга для гранулирования VIC и ресуспендирования в подходящей среде. Наконец, засейте небольшой объем клеточной суспензии на многолуночный планшет, чтобы облегчить адгезию ВИК к дну лунки. Инкубируйте, чтобы позволить ВИК размножаться.

Перед началом эксперимента очистите и простерилизуйте все хирургические инструменты и рабочее место 70% этанолом и автоклавируйте хирургические инструменты в течение 30 минут. Когда первоначальная настройка будет готова, начните с очистки грудной клетки и области живота 8-недельной усыпленной мыши с использованием этанола.

С помощью ножниц раскройте брюшную полость и грудную клетку мыши. Затем разрежьте между левым предсердием и левым желудочком маленькими хирургическими ножницами. Удалите кровь из сердца, перфузировав 10 миллилитров холодного PBS и разрежьте сердце, оставив 3 миллиметра восходящей аорты. Под стереомикроскопом рассекают аортальный клапан, разрезая сердце горизонтально посередине желудочков и разрезая левый желудочек по направлению к аорте. Затем тщательно рассеките аортальный клапан. Соедините клапаны вместе в небольшой 35-миллиметровой чашке для культуры тканей.

Изолированные клапаны промыть в 75-миллилитровой чашке для клеточных культур с 5 миллилитрами свежеприготовленного 10 миллимолярного холодного HEPES с добавлением антибиотиков и инкубировать в 5 миллилитров коллагеназы I типа в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном встряхивании. После инкубации пробирку центрифугировать в течение 5 минут при 150 х г и однократно промыть гранулу 2 миллилитрами миллимолярных HEPES с вортексированием на высокой скорости в течение 30 секунд.

Соберите полученную суспензию из пробирки в 35-миллиметровую чашку для культивирования и с помощью тонкого пинцета аккуратно перенесите фрагменты ткани в свежую пробирку. Затем инкубируйте гранулу в 15-миллилитровой пробирке в 5 миллилитров коллагеназы типа I при температуре 37 градусов Цельсия при непрерывном перемешивании в течение 35 минут. Разделите клетки путем суспензии с помощью пипетки объемом 1 миллилитр и центрифугируйте при 150 х г в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Дважды очистите ячейки, повторно суспензировав отделенную гранулу в 2 миллилитрах полного DMEM и центрифугируя при 150 x g в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.

Для нанесения покрытия гранулу ресуспендируют в 1 миллилитр готовой среды и добавляют ее в одну лунку 6-луночной чашки для клеточных культур в минимальном количестве среды. Держите тарелки в покое при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. После 3 дней инкубации подтвердите рост, близкий к тканевым остаткам, наблюдая за клетками под микроскопом. Как только будет видна 1000 клеток, осторожно удалите остатки ткани с помощью автоклавного пинцета и смените среду.