Модель антеградной перфузии: техника ex vivo для перфузии изолированного сердца мыши

Начните с того, что поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине. Рассеките грудную полость, чтобы визуализировать сердце. Используйте пипетку с широким отверстием для приложения давления всасывания и аспирации сердца от тела мыши к кончику. Удалите сердце в аорте, чтобы извлечь его из тела мыши.

Погрузите изолированное сердце в стакан, содержащий богатый питательными веществами буфер с антикоагулянтом. Антикоагулянт в буфере образует комплекс с кальцием, присутствующим в кардиомиоцитах – клетках сердечной мышцы, прекращая сокращение сердечной мышцы и препятствуя свертыванию крови.

Затем положите верхушку сердца вниз на подставку для сердца, которая находится в чашке Петри, содержащей подходящий буфер. Зажмите аорту над предсердиями и перенесите зажатое сердце на перфузионную пластину.

Затем возьмите шприц-иглу в сборе, содержащую соответствующий перфузионный буфер. Введите иглу в левый желудочек, прокалывающий камеру желудочка.

Когда аорта зажата, внутрижелудочковая инъекция создает давление в аортальных клапанах, чтобы они открылись. Следовательно, буфер промывает кровь антеградно через коронарные артерии, тщательно перфузируя сердечные мышцы. Наконец, буфер изливается через легочные вены. Это обеспечивает успешную перфузию сердца для последующих применений.

Для забора сердца мыши, после подтверждения эвтаназии и бритья брюшной полости, быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце, и с помощью пластиковой переводной пипетки с кончиком, обрезанным примерно по размеру сердца, всосать сердце в пипетку. Поднимите пипетку, чтобы освободить достаточно места для введения изогнутых ножниц, и используйте ножницы, чтобы вырезать сердце с тыльной стороны, стараясь не повредить предсердия.

Немедленно поместите сердце в стеклянный стакан объемом 30 миллилитров, содержащий ледяной CIB EGTA, примерно на 1 минуту. Когда сокращения прекратятся, поместите сердце в 35-миллилитровую чашку для посева, содержащую ледяной CIB EGTA, и удалите легкие и другие видимые ткани.

Поместите грубо очищенное сердце на подставку для сердца, наполненную охлажденным CIB EGTA, вершиной вниз и поместите подставку под стереоскопический микроскоп. Удалите жир и соединительные ткани вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком велика, обрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией и ориентируйте сердце так, чтобы передняя поверхность была обращена вперед. Используйте пинцет, чтобы приподнять конец аорты, и используйте небольшой сосудистый зажим, чтобы зажать аорту рядом с предсердиями, при этом мягко надавливая на предсердия.

Затем поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх и увлажните сердце несколькими каплями CIB EGTA. Для антеградной перфузии загрузите 20-миллилитровый шприц, содержащий предварительно подогретый CIB EGTA, подключенный к гибкой удлинительной трубке и маркированной инъекционной игле, в инфузионный насос и запустите насос со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту. Когда игла и насос будут заполнены, поместите иглу для инъекций на перфузионную пластину так, чтобы более короткая сторона диагональной формы была впереди, и сдвиньте иглу до тех пор, пока она не коснется верхушки сердца.

Осторожно введите иглу возле верхушки левого желудочка, в желудочковую камеру, не перекручивая и не отрывая иглу от пластины, наблюдая за меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь должна начать оттекать из коронарной артерии.

С помощью скотча закрепите иглу для инъекции к пластине и увеличьте скорость насоса до 1 миллилитра в минуту. Если сердце успешно перфузировано, поток буфера в капилляре должен быть виден прямо под эпикардом.