Выделение миоволокон: метод получения отдельных миоволокон из собранной мышцы-разгибателя большого пальца мыши (EDL)

Начните с усыпленной мыши в положении лежа на спине. Простерилизуйте его заднюю конечность. Хирургическим путем удалите кожу и фасцию — тонкую оболочку соединительной ткани под кожей — чтобы обнажить нижележащие мышцы задней конечности.

Расположите переднюю большеберцовую мышцу или мышцу ТА на боковой стороне большеберцовой кости. Удерживая дистальное сухожилие ТА, отделите мышцу от подлежащих тканей. Разрежьте мышцу ближе к колену, чтобы иссечь мышцу ТА, обнажив нижележащую мышцу разгибателя пальца или мышцу EDL, расположенную в переднем отделе задней конечности.

Разрежьте дистальное сухожилие EDL и подтяните мышцу EDL к колену. Разрежьте проксимальное сухожилие EDL, чтобы иссечь мышцу EDL. Перенесите собранную мышцу в пробирку с предварительно подогретой средой, содержащей ферменты коллагеназы, и инкубируйте в течение соответствующего времени. Коллагеназы разрушают соединительную ткань, окружающую каждое мышечное волокно или миофибру внутри мышцы. Этот этап пищеварения высвобождает миофибры из внутреннего слоя мышцы.

После инкубации осторожно перенесите переваренную мышцу в многолуночную пластину, содержащую предварительно подогретую среду, чтобы увеличить выживаемость миофибров. Перенесите пластину в нагретый столик стереомикроскопа. Теперь осторожно растирайте переваренные мышцы, чтобы диссоциировать и выпустить отдельные миоволокна в раствор.

Выделенные миофибры EDL могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Опрыскайте все оборудование и задние конечности мыши 70% этанолом. Используйте закаленные ножницы с тонкой изогнутостью и тонкие щипцы, чтобы удалить кожу и обнажить нижележащие мышцы. Удалите окружающую фасцию с помощью тонко изогнутых щипцов, не повреждая нижележащие мышцы.

Чтобы удалить переднюю большеберцовую кость или ТА, захватите дистальное сухожилие ТА щипцами и разрежьте его тонкими ножницами. Удерживая ТА на сухожилии, потяните его к колену и разрежьте мышцу ближе к колену, чтобы обнажить мышцу EDL.

Подтяните дистальное сухожилие EDL с помощью изогнутых щипцов и разрежьте тонкими пружинными ножницами Vannas. Обнажите проксимальное сухожилие EDL, осторожно потянув EDL к колену. Затем разрежьте ножницами проксимальное сухожилие. Инкубируйте мышцы EDL в реакционной трубке при температуре 37 градусов Цельсия на циркуляционной водяной бане. Остановите пищеварение, когда мышцы расслабляются и видны отдельные миоволокна.

Работая под стереобинокулярным микроскопом, оснащенным нагревательной пластиной, промывайте мышцы теплой изолирующей средой, используя пипетку большого диаметра. Диссоциируйте мышцы с помощью пипетки с большим отверстием, пока нужное количество миоволокон не будет свободно плавать в растворе.