Мышь В утробе матери Электропорация: Пространственно-временные Контролируемые трансфекции генов

Общая цель данной процедуры — добиться эффективной трансфекции генов в центральной нервной системе эмбриона мыши в определенный момент развития и в конкретной области мозга. Сначала для этого подготавливаются прецизионные капилляры и электроды игольчатого типа, чтобы предотвратить повреждение матки. Вторым этапом процедуры является освоение уникального метода удержания эмбрионов с использованием оптоволоконного световода для визуализации маленьких эмбрионов с целью прицельного введения ДНК.

Третьим этапом процедуры является проведение электропорации с использованием стержневых электродов на поверхности матки для трансфекции ДНК в поверхностные отделы головного мозга; заключительным этапом является электропорация с помощью игловидных электродов в более глубокие структуры мозга, такие как таламус и гипоталамус. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие специфическую трансфекцию слоев коры или эффективную трансфекцию в таламусе. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как обычная интраутеринная инъекция, является обеспечение лучшей визуализации и контроля места введения в эмбрионы в матке.

Мы используем кабель, подобный оптоволоконному, который позволяет визуализировать эмбрионы с этапа E 9.5, и игольчатые электроды для доставки плазмидной ДНК в глубокие отделы мозга, такие как таламус и гипоталамус. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о развивающемся мозге, такие как нейрональная дифференцировка, паттернирование мозга и нейронные связи. Как правило, лицам, впервые применяющим этот метод, будет сложно, так как трудно правильно сформировать иглу, электрод и точно совместить их положение.

Матка и эмбрионы. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение для понимания того, как изготовить прецизионные игольчатые электроды и как правильно расположить эмбрионы для проведения электропорации. Поскольку эти два этапа являются ключевыми для достижения успешных результатов. Для подготовки капилляров используйте вытягиватель микропипеток в соответствии с инструкциями производителя.

В данной процедуре используются стеклянные капиллярные трубки диаметром один миллиметр без внутреннего волокна. Вытянутые иглы должны иметь размер от 800 мкм до одного миллиметра от кончика при внешнем диаметре менее 60 мкм; с помощью диссекционного микроскопа и пинцета кончики игл обрезают до диаметра от 20 до 30 мкм. Размер каждой иглы измеряют с помощью микрометра.

Затем подготовьте микроэлектроды методом навивки. Навивайте один конец вольфрамовой проволоки на позолоченный штифт. Используйте вольфрамовую проволоку для отрицательных электродов и платиновую проволоку для положительных электродов.

Закрепите проволоку на штифте с помощью парафина. Затем вставьте проволоку в пластиковый стержень ватной палочки и равномерно обмотайте оба конца пленкой. Аккуратно зашлифуйте кончик проволоки мелкой наждачной бумагой, пока его диаметр не достигнет 20–30 µm на самом кончике и 60 µm на расстоянии от 800 µm до 1 mm от кончика. Снова проверьте окончательные размеры с помощью микрометра.

Затем погрузите заточенную проволоку в каплю лака для ногтей, чтобы нанести на всю поверхность проволоки тонкий изоляционный слой. После высыхания лака смочите ватную палочку в ацетоне и удалите лак с последних 200 мкм кончика стержня. Платиновые электроды приобретаются в готовом виде и не требуют подготовки.

В данной процедуре мы используем метод очистки плазмидной ДНК с помощью набора Qiagen 10 P 4-1 Neo Gene Electrode Purify plasma DNA или эквивалентного метода макси-препа. Перенесите 100 µg ДНК в новую пробирку и добавьте 10 µL 1% красителя Fast Green. Доведите объем раствора с помощью TE до 100 µL, чтобы получить конечную концентрацию плазмидной ДНК 1 µg/µL. Осторожно перемешайте раствор путем пипетирования, затем центрифугируйте раствор ДНК в течение пяти минут при 14 000 об/мин при комнатной температуре для удаления примесей и солей.

Перенесите SNAT в новую пробирку. Раствор ДНК можно хранить в пробирке при комнатной температуре на протяжении всей процедуры. Затем подсоедините вытянутую иглу к микроманипулятору согласно инструкциям производителя и погрузите кончик иглы в раствор ДНК, чтобы заполнить её.

Осторожно отставьте микроманипулятор в сторону и проведите предоперационную подготовку. Взвесьте беременную мышь на сроке эмбрионального развития от 9,5 до 15,5 суток, чтобы определить массу тела.

Затем внутрибрюшинно введите натрия пентобарбитал фармацевтической чистоты в дозе 50 µg на г массы тела и подождите пять минут. В качестве альтернативы пентобарбиталу натрия можно использовать кетамин, ксилазин, инъекционные или газовые анестетики.

После проведения анестезии сбрейте шерсть с живота с помощью лезвия бритвы и 50% ethanol. Подготовьте кожу, поочередно обрабатывая ее раствором Betadine и 70% alcohol. Сделайте разрез по средней линии живота с помощью тонких ножниц.

Осторожно извлеките все рога матки, выложив их на увлажненную 1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) хлопковую марлю, расположенную вокруг раны. Постоянно поддерживайте матку во влажном состоянии, используя PBS. Используйте гибкий оптоволоконный кабель.

Поместите кабель под рог матки. Расположите матку между источником света оптического волокна и большим пальцем, затем осторожно сожмите ее, чтобы продвинуть эмбрион ближе к стенке матки. Когда эмбрион будет расположен головой влево и лицом вверх, осторожно введите стеклянный капилляр в целевой желудочек и введите примерно один микролитр раствора ДНК для электропорации четвертого слоя коры на 13,5 день эмбрионального развития.

Поместите платиновые стержневидные электроды снаружи матки и подайте квадратные импульсы тока пять раз при напряжении 38 вольт и длительности 50 миллисекунд. При использовании микроэлектропорации для достижения таламуса или гипоталамуса на 10,5 эмбриональный день введите тонкий вольфрамовый отрицательный электрод в желудочек, в который была введена ДНК, а платиновый положительный электрод — в матку. Расположите целевую область между концами обоих электродов и подайте рекомендуемые квадратные импульсы тока три раза при напряжении семь вольт и длительности 100 миллисекунд.

После завершения электропорации верните рог матки в исходное положение и добавьте 500 µL PBS. Наложите шов на внутренний слой разреза с помощью хирургического шва. Затем закройте внешний слой с помощью девятимиллиметрового автоматического зажима.

Поместите мышь на грелку на два часа для восстановления после операции и наркоза. Здесь показана электропорация платиновым электродом области коры, проведенная на эмбриональных стадиях E13.5, E14.5 и E15.5. Головной мозг был извлечен в постнатальный период.

Шестой день. Слой электропорированных клеток коры четко различается в каждом эксперименте. Это позволяет предположить, что электропорация, зависящая от времени, делает возможным специфическое приобретение или потерю функций в различных слоях коры.

Здесь показана электропорация глубоких тканей, таких как таламус и гипоталамус. Использование платиновых стержневых электродов часто характеризуется низкой эффективностью; применение микроэлектродов для электропорации обеспечивает более высокую эффективность и жизнеспособность клеток в этих глубоких тканях.

Мы ввели раствор плазмидной ДНК в третий желудочек эмбрионов мыши. На 11,5 день эмбрионального развития мы провели игольчатую электропорацию, ограниченную таламусом; большинство аксонов таламуса проецируются в кору к шестому дню после рождения. Здесь мы демонстрируем микроэлектропорацию P-C-A-G-E-Y-F-P в развивающуюся головку эмбриона.

Область таламуса отмечена RORC, который маркирует все постмитотические нейроны таламуса. Проекции аксонов в четвертый слой коры, показанные белыми стрелками, также могут быть визуализированы с помощью EYFP, который заполняет весь нейрон. Положение четвертого слоя коры также отмечено антителом к RORC.

После начала MA эта процедура может быть выполнена за 15 минут на один литр при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно крайне осторожно обращаться с исследуемым образцом, чтобы избежать любых повреждений в ходе процесса. Для понимания молекулярного механизма спецификации клеток после их развития могут быть применены другие методы, такие как введение специфического хромофора в MDNA.

Данный метод открывает перед исследователями в области развития центральной нервной системы возможности для изучения молекулярных механизмов паттернирования, роста аксонов и формирования нейронных цепей.