Мышь В утробе матери Электропорация: Пространственно-временные Контролируемые трансфекции генов

Общая цель этой процедуры заключается в получении эффективной трансфекции генов в центральной нервной системе эмбриональной мыши в желаемый момент развития и в нужной области мозга. Это достигается в первую очередь путем подготовки прецизионных капилляров и электродов игольчатого типа для предотвращения повреждения матки. Вторым этапом процедуры является изучение уникального метода удержания эмбрионов с помощью оптоволоконного светового кабеля для визуализации маленьких эмбрионов для целенаправленного введения ДНК.

Третьим этапом процедуры является проведение электропорации электродами игольчатого типа на поверхности матки с целью трансфекции ДНК в поверхностные участки мозга, заключительным этапом процедуры является проведение электропорации с помощью электродов игольчатого типа в более глубокие структуры мозга, такие как таламус и гипоталамус. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают кортикальный слой, специфическую трансфекцию или эффективную трансфекцию в таламусе. Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими беспорядками, такими как регулярная, в нейтральной фазе, заключается в том, что она имеет большую видимость и контроль места латы эмбрионов в матке.

Мы используем оптоволоконный кабель, который позволяет визуализировать эмбрионы из E 9.5 и игольчатые гипо для передачи плазмидной ДНК в более глубокие части мозга, такие как таламус и гипоталамус. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о развивающемся мозге, такие как нейронная дифференциация, паттерны мозга, нейронные связи. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что трудно придать форму игле, электродороге и коллективному положению.

Матка и эмбрионы Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для того, чтобы увидеть, как сделать точные игольчатые электроды и как расположить эмбрионы для свободного электро. Так как эти два шага являются ключевыми для успешного результата. Для приготовления капилляров используйте съемник микропипеток в соответствии с инструкциями производителя.

В этой процедуре мы используем стеклянные капиллярные трубки диаметром в один миллиметр без внутреннего волокна. Выдернутые иглы следует отжимать на расстоянии от 800 микрометров до одного миллиметра от кончика с внешним диаметром менее 60 микрометров с помощью диссекционного микроскопа, а щипцами отщипывать кончики игл до диаметра от 20 до 30 микрометров. Измерьте каждую иглу с помощью микрометра.

Далее подготавливаем микроэлектроды методом намотки. Один конец вольфрамовой проволоки вокруг позолоченного булавки. Используйте вольфрамовую проволоку для отрицательных электродов и платиновую проволоку для положительных электродов.

Закрепите провод на штыре с помощью параметра. Затем вставьте проволоку в пластиковый стержень ватной палочки и обмотайте оба конца фимом, равномерно заточите кончик проволоки мелкой наждачной бумагой, пока он не достигнет 20 – 30 микрометров на кончике и 60 микрометров между 800 микрометрами и одним миллиметром от кончика. Опять же, проверьте окончательные размеры с помощью микрометра.

Далее погрузите заточенный провод в каплю лака для ногтей, чтобы нанести тонкий слой на весь провод для изоляции. После того, как лак для ногтей высохнет, используйте ацетон так, чтобы ватным тампоном удалить его с последних 200 микрометров кончика палочки. Платиновые электроды приобретаются в готовом виде и не нуждаются в подготовке.

В этой процедуре мы используем электрод гена CUY six 10 P four dash one nepo Очистите плазменную ДНК с помощью макси-препа или эквивалентного метода, внесите 100 микрограммов ДНК в новую пробирку и добавьте 10 микролитров 1%-ного быстрого зеленого красителя. Используйте TE, чтобы довести объем до 100 микролитров для конечной концентрации ДНК в плазме крови в один микрограмм на микролитр. Осторожно перемешайте раствор с помощью пипетирования, затем вращайте раствор ДНК в течение пяти минут при комнатной температуре 14 000 об/мин, чтобы удалить примеси и соли.

Переложите SNAT в новую трубку. Раствор ДНК можно хранить при комнатной температуре в пробирке в течение всей процедуры. Далее подключите вытянутую иглу к микроманипулятору согласно инструкции производителя, погрузите кончик иглы в раствор ДНК для заполнения иглы.

Осторожно отложите микроманипулятор в сторону и подготовьтесь к операции перед операцией. Взвесьте беременную мышь в эмбриональные дни. от 9,5 до 15,5 для определения массы тела.

Затем внутрибрюшинно. Вводите пентобарбитал натрия фармацевтического класса в концентрации 50 микрограммов на грамм массы и веса тела в течение пяти минут. Альтернативы пентобарбиталу натрия могут включать кетамин, ксилазин, выброс или газовые анестетики.

После обезболивания используйте бритвенное лезвие и 50% этанол для сбривания волос на животе. Подготовьте кожу, чередуя скрабы из бетадина и 70% спирта. Сделайте разрез по средней линии живота тонкими ножницами.

Осторожно вытяните все рога матки на буферный фосфатный раствор или влажную и ватную марлю PBS, помещенную вокруг раны. Постоянно поддерживайте матку во влажном состоянии с помощью PBS. С помощью гибкого оптоволоконного кабеля.

Поместите кабель под маточный рог. Расположите матку между оптическим волокном и большим пальцем и осторожно сожмите, чтобы подтолкнуть эмбрион ближе к стенке матки. Когда эмбрион расположен головой слева и лицом вверх, осторожно введите стеклянный капилляр в целевой желудочек и введите примерно один микролитр раствора ДНК для электропорации коркового слоя 4 На эмбриональный день 13,5.

Поместите платиновые электроды за пределы матки и подайте прямоугольные импульсы тока пять раз, используя напряжение 38 вольт, в течение 50 миллисекунд. При использовании микроэлектропорации для достижения таламуса или гипоталамуса на 10,5-й день эмбрионального периода введите тонкий вольфрамовый отрицательный электрод в ДНК-введенный желудочек, а платиновый положительный электрод - в матку. Поместите целевую область между концами обоих электродов и подайте предложенные прямоугольные импульсы тока три раза при напряжении семь вольт в течение 100 миллисекунд.

После того как электропорация будет завершена, верните маточный рог на исходное место и добавьте 500 микролитров PBS. Сшить внутренний слой разреза хирургическим швом. Затем закройте внешний слой девятимиллиметровым автозажимом.

Поместите мышь на грелку на два часа, чтобы дать возможность восстановиться после операции и анестезиологической палочки. Здесь наблюдается применение платиновой электропорации корковой области в эмбриональных днях 13,5, 14,5 и 15,5. Мозг был собран в постнатальном периоде.

День шестой. Слой корковых клеток, подвергнутых электропоре, явно отличается в каждом эксперименте. Предположение о том, что зависящая от времени электропорация делает возможным специфическое усиление функции и потерю функции кортикальных слоев.

Как показано здесь, электропорация в глубокие ткани, такие как таламус и гипоталамус. Использование платиновых электродов часто дает низкую эффективность при использовании микроэлектродов для электроработы. Эти глубокие ткани обеспечивают лучшую эффективность и жизнеспособность.

Мы вводили раствор плазменной ДНК в третий желудочек эмбрионов мышей. На эмбриональный день 11,5 мы применили игольчатую электропорацию, ограниченную таламусом, большинство экзонов таламуса проецируются в кору головного мозга к постнатальному шестому дню. Здесь мы показываем микроэлектропорацию P-C-A-G-E-Y-F-P в развивающийся головной мозг.

Область таламуса показана с помощью RORC, который маркирует все таламические постмитотические нейроны. Проекции аксонов, показанные белыми стрелками в четвертый слой коры, также могут быть визуализированы с помощью EYFP, который заполняет весь нейрон. Положение четвертого слоя в коре также помечается антителом RORC.

Как только начнется МА, эту технику можно выполнить за 15 минут на литр, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что с тестом нужно обращаться очень осторожно, чтобы предотвратить любые повреждения после этой процедуры. Другие методы, такие как включение определенного хрома в МДНК, могут быть выполнены для того, чтобы понять молекулярный механизм спецификации клетки после ее развития.

Этот метод представляет собой метод обработки струнной волны для исследователей в области развития центральной нервной системы для изучения молекулярных механизмов в формировании паттернов, роста аксонов и формирования цепей.