Количественный анализ бактериальной инфекции: метод количественной оценки внутриглазной бактериальной нагрузки на мышиной модели бактериального эндофтальмита

Бактериальный эндофтальмит — это воспалительное заболевание глаз, которое возникает, когда Bacillus cereus — патогенная бактерия — поражает внутриглазную область.

Чтобы количественно оценить бактериальную инфекцию, положите усыпленную мышь с бактериальным эндофтальмитом латерально на операционный стол. Слегка надавите на глаз, чтобы помочь отделить глазное яблоко от глазницы. Перенесите глазное яблоко в трубку, содержащую соответствующий буфер, дополненный коктейлем ингибиторов протеазы.

Гомогенизируйте ткань глаза, чтобы разрушить ее, высвободив бактерии из суспензии. Ингибиторы протеазы, присутствующие в буфере, инактивируют высвобождаемые клеточные протеазы для поддержания жизнеспособности бактерий. Далее последовательно разводят бактериальную суспензию для получения различных концентраций Bacillus cereus.

Возьмите наклонную культуральную пластину, содержащую обогащенную агаровую среду, и разграничьте ряды, соответствующие каждой концентрации разведения. Нанесите несколько капель из бактериальной суспензии на верхнюю часть обозначенного ряда и дайте ей стечь вниз, пока она не достигнет конца пластины, способствуя равномерному распространению бактерий. Разровняйте тарелку и инкубируйте.

Во время инкубации каждая бактерия использует питательные вещества из агара для размножения и формирования отдельных колоний. Количество колоний уменьшается, что соответствует увеличению разведения бактериальной суспензии. Подсчитайте количество колоний в определенном ряду, чтобы количественно оценить бактериальную нагрузку глаза.

В подходящей экспериментальной конечной точке добавьте 400 микролитров PBS с добавлением ингибитора протеазы в одну меченую автоклавную пробирку для сбора урожая на каждый глаз на лед и поместите открытые щипцы с тонким наконечником по обе стороны от инфицированного глаза. Надавите кончиками вниз по направлению к голове, чтобы проптопировать глаз.

Когда щипцы окажутся за глазным яблоком, сожмите щипцы вместе и оттяните щипцы от головки, чтобы отделить глазное яблоко. Затем сразу же поместите глазное яблоко в пробирку для сбора урожая с соответствующей маркировкой. В течение 60 минут после сбора образцов поместите закрытые пробирки для сбора в тканевый гомогенизатор и гомогенизируйте образцы в течение двух одноминутных периодов гомогенизации с 30-секундным периодом отдыха между ними.

После гомогенизации поместите образцы на лед и используйте 20 микролитров аликвот гомогената для последовательного разбавления образцов в 180 микролитрах PBS на одно разведение до тех пор, пока не будет достигнут коэффициент 1 умножить на 10 до отрицательных 8. Затем пометьте каждый ряд квадратной предварительно нагретой пластины BHI соответствующей концентрацией разбавления и, наклонив пластину под углом 45 градусов, добавьте по 10 микролитров каждого разбавления в отдельные ряды в верхней части пластины. Дайте каждому образцу пройтись, пока он почти не достигнет дна пластины, прежде чем положить пластину на плоскую поверхность. Когда образцы впитаются в агар, перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Колонии должны стать заметными уже через восемь часов инкубации.

Чтобы получить точное представление о концентрации в образце, посчитайте строку, содержащую от 10 до 100 колоний.