Выделение клеток IPE и RPE: методика получения глазных пигментных эпителиальных клеток из кроличьего глаза

Клетки пигментного эпителия представляют собой терминально дифференцированные кубовидные клетки, соединенные плотными соединениями. Эти эпителиальные клетки, выстилающие радужную оболочку, являются пигментными эпителиальными клетками радужки или IPE, а те, что находятся рядом с сетчаткой, являются клетками пигментного эпителия сетчатки или RPE.

Чтобы извлечь эти клетки, берут неповрежденный кроличий глаз. Обработайте глаз дезинфицирующим средством, чтобы удалить любые микроорганизмы с поверхности глаза. Смойте дезинфицирующее средство буферным раствором. Сделайте надрез возле радужной оболочки. Используя это отверстие, сделайте полный круговой разрез вдоль границы радужной оболочки, разделив глаз на передний сегмент, содержащий радужную оболочку, и заднюю часть, содержащую сетчатку и стекловидное тело.

Возьмите передний сегмент и выбросьте хрусталик, чтобы получить доступ к радужной оболочке. Удалите ирис и положите его на чашку для культуры. Впоследствии возьмите задний отрезок и отбросьте студенистое стекловидное тело и сетчатку из глазной луковицы.

Обработайте радужную оболочку и глазную луковицу трипсином и инкубируйте. Трипсин разрушает плотное соединение и белки внеклеточного матрикса, инициируя диссоциацию эпителиальных клеток. Выбросьте трипсин и добавьте подходящую питательную среду. Аккуратно соскребите поверхность радужной оболочки и глазного яблока, чтобы высвободить эпителиальные клетки в среде.

Наконец, засейте ячейки IPE и RPE в отдельные лунки. Клетки готовы к дальнейшим последующим анализам.

После усыпления животного используйте изогнутые ножницы и щипцы Colibri для энуклеации глаз, затем очистите глаза от оставшейся мышечной ткани и кожи. Соберите глаза в 50-миллилитровую трубку, наполненную нестерильным PBS, и перенесите трубку в колпак ламинарного потока. Продезинфицируйте их, погрузив в раствор на основе йода на две минуты, затем переложите глаза в 50-миллилитровую трубку, наполненную стерильным ПБС.

Положите один глаз на стерильный марлевый компресс и крепко прижмите глаз близко к зрительному нерву, затем разрежьте около границы радужной оболочки скальпелем #11. С помощью ножниц разрежьте вокруг радужной оболочки глаза, удалите передний сегмент и поместите его в чашку Петри, оставив луковицу со стекловидным телом, до тех пор, пока не будут выделены пигментные эпителиальные клетки сетчатки, или клетки RPE.

Чтобы изолировать эпителиальные пигментные клетки радужной оболочки или клетки IPE, удалите хрусталик тонкими щипцами и осторожно вытащите радужную оболочку, содержащую клетки IPE. Поместите ирис в чашку Петри, и промойте ее стерильным PBS. Добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина, и выдерживайте в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды и аккуратно соскребите IPE плоской отполированной пипеткой Пастера.

Соберите клеточную суспензию, и поместите ее в 1,5-миллилитровую пробирку. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра и засейте 0,2 миллиона клеток в лунку в 24-луночный планшет с 1 миллилитром полной среды. Поместите планшет в инкубатор и культивируйте его при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Чтобы изолировать клетки РПЭ, удалите стекловидное тело и сетчатку из заднего сегмента с помощью тонких щипцов. Поместите луковицы в 24-луночную тарелку, добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина на глаз и выдерживайте в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите трипсин, добавьте 500 микролитров полной среды на каждый шарик и аккуратно соскребите клетки РПЭ изогнутой пипеткой Пастера, отполированной огнем.

Соберите клеточную суспензию, и поместите ее в 1,5-миллилитровую пробирку. Подсчитайте клетки с помощью камеры Нейбауэра и засейте клетки, как описано ранее. Поместите тарелку в инкубатор.