Ex vivo модель биопленки в легких свиньи: методика разработки модели легких для изучения бактериальных биопленок в бронхиолярной ткани свиньи

Бронхиолы – это трубчатые дыхательные пути легких. Во время хронической инфекции бронхиолы закупориваются из-за скопления слизи. Богатая питательными веществами слизь обеспечивает подходящую среду для роста условно-патогенных бактерий. Эти бактерии встраиваются в самостоятельно производимый внеклеточный полимерный матрикс и размножаются, образуя биопленку.

Чтобы имитировать развитие бактериальной биопленки в легких, возьмите образец бронхиолярной ткани свиньи в чашке Петри. Рассекаем ткань на кусочки нужной формы. Добавьте в чашку Петри питательную среду для биопленки. Простерилизуйте посуду под воздействием ультрафиолетового излучения, чтобы удалить любые поверхностные загрязнения.

Перенесите стерилизованные кусочки ткани в многолуночный планшет, содержащий биопленочные питательные среды и агарозные прокладки, которые служат оптимальным субстратом для бактериальной адгезии. Затем наколите кончик иглы, содержащий колонию нужных бактерий, на каждый кусочек ткани, чтобы ввести планктонные бактерии в ткань. Запечатайте пластину пористой мембраной, стерилизованной ультрафиолетом, которая способствует равномерному кислородному обмену по всей поверхности пластины. Инкубируйте герметичную тарелку.

Во время инкубации бактерии необратимо прикрепляются к поверхности эпителия через пили и начинают выделять внеклеточный матрикс. Внутри матрикса бактерии используют источники энергии, муцин и свободную ДНК из питательных сред для образования биопленок. Модель бактериальной биопленки готова к дальнейшему тестированию.

Поместите бронхиолу в первую стирку DMEM/RPMI 1640. Оставьте его в промывке и соберите дополнительные срезы бронхиолы из того же легкого, чтобы получить достаточное количество срезов ткани для запланированного эксперимента. Поместите в промывку все дополнительные бронхиолярные срезы из того же легкого и оставьте их в промывке не менее чем на две минуты.

Удалите бронхиолы из первой промывки и поместите образцы в стерильную чашку Петри. Слегка придерживайте каждую бронхиолу стерильными щипцами, стараясь не повредить ткани. Удалите как можно больше оставшихся мягких тканей, и разрежьте ткань на полоски шириной пять миллиметров с помощью стерильных ножниц для препарирования.

Поместите все полоски бронхиолярной ткани во вторую полоску для мытья DMEM/RPMI 1640. Оставьте их в стирке не менее чем на две минуты. Затем извлеките полоски ткани со второго промывания с помощью стерильных щипцов, и поместите их в чистую стерильную чашку Петри. Удалите остатки мягких тканей, прикрепленных к бронхиоле, и разрежьте полоски на квадраты с помощью стерильных ножниц для препарирования.

Добавьте третью промойку DMEM/RPMI 1640 в чашку Петри и слегка перемешайте кусочки салфетки в воде, поворачивая чашку. Третью смывку вылейте из чашки Петри, не удаляя кусочки ткани.

Затем добавьте окончательную промывку SCFM, убедившись, что все кусочки салфетки покрыты. Стерилизуйте ткань в SCFM под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут. С помощью стерильных щипцов перенесите каждый стерилизованный кусочек бронхиолярной ткани в отдельные лунки 24-луночного планшета, содержащего агарозные прокладки SCFM.

Чтобы заразить каждый кусочек ткани желаемым штаммом бактерий, прикоснитесь к колонии, выращенной на агаровой пластине, кончиком иглы 29-го калибра, прикрепленной к стерильному инсулиновому шприцу объемом 0,5 миллилитров. Затем прикоснитесь колонией к кусочку ткани, осторожно прокалывая поверхность. Для неинфицированных контрольных групп аккуратно проколите поверхность кусочка ткани кончиком иглы.

Затем с помощью пипетки добавьте 500 микролитров SCFM в каждую лунку. Стерилизуйте дышащую уплотнительную мембрану для каждой 24-луночной пластины под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут. Снимите крышку с 24-луночной пластины и замените ее дышащей мембраной. Затем инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия без встряхивания.