Культивирование переднего отрезка глаза: метод культивирования роговицы, несущей передний отрезок свиного глаза

Для культивирования переднего отрезка глаза начните с подходящей чашки для культуры. Чашка для культур имеет приподнятую ступень в центре, соединенную с двумя отверстиями для притока и оттока жидкости.

Во-первых, поместите над сценой свежий передний сегмент глаза свиньи, содержащий роговицу. Впоследствии поместите зажимное кольцо на глазной сегмент и закрепите его. Затем приготовьте перфузионную установку, состоящую из шприца, заполненного подходящей питательной средой. Подсоедините шприц к клапану, фильтру и трубке с помощью изогнутой игольчатой ступицы на другом конце.

Подготовьте аналогично собранный резервуар с помощью пустого шприца. Теперь подсоедините игольчатые ступицы перфузии и резервуара к входному и выходному портам соответственно. Аккуратно проделайте перфузию носителя и дайте переднему сегменту надуться.

Продолжайте перфузию и дайте пузырькам и лишней среде стечь в резервуар. После этого инкубируйте чашку для культивирования на нужной высоте и в стандартных физиологических условиях. В результате получается трехмерная модель, которая имитирует сложную архитектуру глаза в физиологических условиях.

Подключите датчик давления к клапану резервуара, чтобы постоянно контролировать глазное давление. Теперь передний сегмент глаза готов к использованию для дальнейших экспериментов.

Поместив передний сегмент в чашку Петри, смочите ватный тампон в средстве и аккуратно промокните центр роговицы, чтобы удалить любой пигмент. Зажмите глаза щипцами и удалите лишний пигмент вокруг склеры, протерев их. Поместите перевернутый передний сегмент над возвышенной областью нижней чаши, следя за тем, чтобы роговица оставалась в центре возвышенной области.

Поместите зажимное кольцо поверх только что установленного переднего сегмента и осторожно затяните винты с помощью L-образного ключа. Прикрепите оба жидкостных соединителя с уплотнительными кольцами к резьбовым портам на дне посуды. К первому жидкостному соединителю прикрепите изогнутую под углом 90 градусов ступицу иглы 18-го калибра, отрезок трубки, ступицу иглы 18-го калибра, нейлоновый шприцевой фильтр, трехходовой клапан и 20-миллиметровый шприц, наполненный фильтрующим материалом.

Ко второму жидкостному соединителю прикрепите изогнутую на 90 градусов игольчатую втулку 18-го калибра, длинную трубку, ступицу иглы 18-го калибра, трехходовой клапан, как показано для первого жидкостного соединителя, а затем прикрепите цилиндрическую часть стерильного 10-миллилитрового шприца, который будет действовать как резервуар для сбора жидкости и пузырьков.

Держа трехходовые клапаны открытыми в соответствии со шприцами, осторожно протолкните среду через систему с помощью первого соединительного порта жидкости. Чтобы надуть передний сегмент, заполните трубку средой и, в конечном итоге, заполните резервуар. Удалите пузырьки, осторожно вдавливая среду в форму, и переверните чашку, чтобы вытолкнуть пузырьки.

Поместите чашку для культивирования органов переднего сегмента в инкубатор для клеточных культур. Направьте трубопроводки через нижнюю часть дверцы инкубатора, чтобы предотвратить создание помех при открытии и закрытии дверцы. Расположите трубопроводы НКТ с резервуаром на приборе датчика давления. Подсоедините боковой трехходовой клапан к преобразователю давления, пока PBS проходит по линии, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в трубопроводы.