Система микробиореактора с жидким мрамором: 3D-протокол культивирования для инкапсуляции ооцитов свиней

Приготовьте слой из порошка фторированного этиленпропилена, или FEP, в чашке для культивирования. Добавьте каплю среды созревания, содержащей кумулюс-ооцитарные комплексы, или КОК, в порошок FEP. Аккуратно раскатайте каплю по порошку, чтобы получился жидкий шарик, или LM. Порошок FEP создает гидрофобную пористую оболочку, обеспечивающую газообмен между внутренней жидкостью и окружающей средой.

Теперь соберите блок LM и перенесите его в центральную лунку чашки Петри для ЭКО. Добавьте стерильную воду в наружное кольцо, чтобы сохранить КОК увлажненными. Затем инкубируйте LM в физиологических условиях, чтобы обеспечить созревание ооцитов.

Далее удалите отработанную среду и добавьте свежую среду для созревания. Прямой контакт с жидкостью разрушает гидрофобную оболочку FEP и разрушает LM, высвобождая COC. Высвободившиеся КОК переложите в новую посуду, содержащую свежую каплю среды для созревания, и промойте их для удаления частиц FEP.

После промывки перенесите КОК и свежую среду на слой порошка FEP. Скатайте каплю, чтобы покрыть ее порошком. Наконец, перенесите ЛМ в чашку Петри для ЭКО. ЛМ с порошковым покрытием FEP поддерживают трехмерную структуру ооцитов и повышают их жизнеспособность.

Сделайте подушку из 5 грамм порошка FEP в 30-миллиметровой чашке Петри. Распределите одну каплю среды для созревания, содержащую от 3 до 5 КОК, на порошок FEP. Осторожно вращайте пластину круговыми движениями, чтобы частицы полностью покрыли поверхность капли жидкости и образовали жидкие шарики или LM.

Приготовьте несколько 60-миллиметровых чашек Петри для ЭКО и добавьте от 3 до 4 миллилитров стерильной воды к наружным кольцам, чтобы создать камеру влажности. Возьмите сформированный LM с помощью пипетки объемом 1000 микролитров и поместите его в центральную лунку. Инкубируйте шарики в течение четырех дней при температуре 38 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом.

Чтобы изменить среду, нанесите 30 микролитров среды для созревания на каждую LM, что приведет к ее растеканию. Когда содержимое мрамора растворится, перенесите КОК, высвободившиеся из биореактора, в каплю свежей среды созревания в чашке Петри. После 3-4 промывок в среде для созревания перенесите COC вместе с 30 микролитрами свежей среды в слой порошка FEP.

Аккуратно вращайте пластину круговыми движениями, чтобы частицы порошка полностью покрыли поверхность капли жидкости и образовали новую LM. Затем перенесите ЛМ в чашку Петри для ЭКО.