Лазерная селективная абляция эндотелиальных клеток роговицы свиней: метод индуцирования фокусированного повреждения эндотелия роговицы свиньи для исследований ex vivo

Самый внутренний слой роговицы свиньи - прозрачная аваскулярная часть переднего глаза - состоит из эндотелиальных клеток роговицы, или ЦЭК, поддерживаемых базальной мембраной - десцеметовой мембраной, или ДМ. КЭК поддерживают прозрачность роговицы и оптимальное зрение. Любое повреждение их может повлиять на зрение.

Для выборочного повреждения CEC начните со свежесобранного свиного глаза в подходящей среде. Удалите окружающие ткани. Обработайте глаз соответствующим дезинфицирующим средством, чтобы устранить поверхностное микробное загрязнение. После промывания солевым раствором оптически осмотрите переднюю часть глаза, чтобы исключить любые аномалии перед лазерным облучением.

Закрепите глаз в специальном удерживающем устройстве перед устройством с щелевой лампой, оснащенным лазером определенной длины волны. Визуализируйте отдельные слои роговицы. При соответствующей энергии лазера и положении точки фокусировки направьте лазерные импульсы на эндотелиальный слой роговицы. Сфокусированные кратковременные импульсы высокой мощности вызывают селективный разрыв CEC с открытой поверхностью, избегая при этом диффузии тепла, тем самым защищая DM или стромальную ткань.

Создав входной порт рядом с лимбом – корнеосклеральный переход, ввести вязкоэластичный раствор в переднюю камеру, содержащую роговицу, для ее стабилизации и защиты оставшихся ЦЭК. Вырежьте и перенесите обработанный лазером сегмент роговицы в многолуночную пластину, содержащую среду, стороной CEC вверх. Модель повреждения эндотелия роговицы ex vivo может быть использована для дальнейших исследований.

После получения свежеэнуклеированных свиных глаз на местной скотобойне, поместите образцы при температуре 4 градуса Цельсия, полной средней. С помощью ножниц удалите внеклеточные ткани, и замочите глаза в 5% офтальмологическом растворе повидон-йода на пять минут. Далее поместите продезинфицированные образцы в стерильную PBS при комнатной температуре.

Используя аппарат оптической когерентной томографии в спектральной области, проведите скрининг глаз на наличие основных патологий переднего сегмента, таких как рубцевание роговицы, отек и другие помутнения. После скрининга расположите глаза перед блоком щелевой лампы, оснащенным лазером Nd:YAG с длиной волны 1064 нанометра и диаметром фокусного пятна 10 микрометров на воздухе. Выберите 12-кратное увеличение и отклоните освещение, чтобы визуализировать отдельные слои роговицы.

После установки энергии импульса и точки фокусировки на соответствующие параметры для селективной абляции эндотелиальных клеток роговицы нанесите на ткань несколько лазерных уколов. Затем под рассекающим микроскопом поместите прозрачный парацентез роговицы близко к лимбу и введите вязкоэститик для стабилизации внутренней камеры. Затем с помощью 8-миллиметрового трепана иссеките центральную роговицу, обработанную лазером, и поместите изолированную роговицу в одну лунку 12-луночного планшета эндотелиальной стороной вверх. Когда все роговицы будут собраны, добавьте 3 миллилитра полной среды в каждую лунку для образца и инкубируйте образцы до трех дней при температуре 37 градусов Цельсия.