Выделение эндотелиальных клеток аорты свиней (pAEC): метод на основе ферментов для выделения эндотелиальных клеток из собранной свиной брюшной аорты
JoVE Encyclopedia of Experiments
Биология
0 просмотров • 4:50 мин • July 8th, 2025
Аорта - главная артерия, несущая насыщенную кислородом кровь от сердца к телу - состоит из трех слоев, или «туник»: внутренней интимы, средней среды и внешней адвентиции. Эндотелиальные клетки или ЭК присутствуют в интиме в виде тонкого, непрерывного монослоя над поддерживающей базальной мембраной, состоящей из структурных белков, в первую очередь коллагена.
Чтобы изолировать ЭК, начните с забора свиной аорты в чашке для культивирования. Иссеките его концы и любые окружающие адгезивные ткани, чтобы предотвратить загрязнение неэндотелиальными клетками. Промойте аорту буфером, содержащим антибиотики, чтобы подавить рост микроорганизмов.
Проведите стерильный хирургический шов через аорту и завяжите один из его концов, удерживая шов в пределах просвета. Закрепите завязанный конец и втяните шов, чтобы полностью вывернуть аорту. Это подвергает ЭК-содержащую интиму ферментативному перевариванию. Обработайте аорту предварительно подогретым раствором коллагеназы с низкой концентрацией для оптимальной активности ферментов и инкубируйте.
Коллагеназа расщепляет коллагеновые белки, присутствующие в базальной мембране, лежащей под ЭК, инициируя их диссоциацию. После инкубации добавьте охлажденный буфер для инактивации ферментов коллагеназы.
Аккуратно соскребите поверхность аорты и промойте ее буфером, чтобы высвободить ЭК в раствор. Центрифугируйте этот раствор для гранулирования ECs. Повторно суспендируйте гранулу в подходящей среде. Высейте клеточную суспензию в культуральную колбу и инкубируйте. КЭ прилипают к дну колбы и разрастаются.
Для выделения эндотелиальных клеток аорты свиньи перенесите аорту свиньи в 150-миллиметровую чашку Петри в асептических условиях и аккуратно удалите оба конца сосуда. Обрежьте лишнюю ткань в месте зажатия сосуда стерильными щипцами и ножницами и используйте от 20 до 50 миллилитров свежего буфера для промывки снаружи и внутри аорты.
Далее проденьте хирургический шов через аорту, и неплотно завяжите один конец сосуда, удерживая шов в пределах просвета. Аккуратно зафиксируйте аорту возле перевязанного конца щипцами, а затем медленно потяните хирургические швы, чтобы перевернуть аорту, пока эндотелиальная поверхность аорты не обнажится.
Промойте эндотелиальную поверхность аорты три раза 10 миллилитров свежего промывочного буфера на одну промывку и поместите аорту в центрифугу объемом 15 миллилитров. Налейте на образец 10 миллилитров нагретого при температуре 37 градусов Цельсия 0,005% коллагеназы внутривенно и инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
В конце инкубации переложите все содержимое пробирки в 100-миллиметровую чашку для культур и остановите сбраживание с помощью от 10 до 15 миллилитров предварительно охлажденного буфера. С помощью скребка для клеток аккуратно удалите эндотелиальные клетки аорты с внутренней поверхности сосуда и трижды промойте сосуд 5 миллилитрами промывочного буфера на одну промывку.
После последней промывки переложите надосадочную жидкость в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и дважды промойте дно чашки для культивирования 5 миллилитров свежего промывочного буфера за одну промывку, объединив промывки в 50-миллиметровой пробирке.
Соберите клетки центрифугированием и выбросьте все, кроме последних 10 миллилитров надосадочной жидкости. Добавьте 20 миллилитров промывочного буфера, чтобы повторно суспендировать гранулы, стараясь избежать образования пузырей, и соберите клетки с помощью еще одного центрифугирования.
Повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр среды для культивирования клеток для подсчета и поместите клетки в соотношении от 1 x 10 до 6 клеток на 25 см в квадрате колбы. Затем поместите клетки в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, обновляя среду каждые 2-3 дня.
Обзор
В данной статье описывается метод выделения эндотелиальных клеток (ЭК) аорты свиньи, в котором подробно изложены необходимые этапы для обеспечения чистоты и жизнеспособности клеток. В протоколе подчеркивается важность соблюдения правил асептики и применения ферментативного переваривания для эффективного извлечения клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Биология сосудов
- Исследование эндотелиальных клеток
Теоретические основы
- Аорта является основной артерией, отвечающей за транспорт оксигенированной крови.
- Она состоит из трех слоев: интимы, медии и адвентиции.
- Эндотелиальные клетки образуют критически важный монослой в интиме.
- Изоляция этих клеток необходима для проведения различных биологических исследований.
Цель исследования
- Представить детальный протокол выделения эндотелиальных клеток аорты свиньи.
- Обеспечить такую методологию, которая минимизирует контаминацию и максимизирует выход клеток.
- Создать основу для дальнейших исследований поведения и функций эндотелиальных клеток.
Используемые методы
- Забор аорты свиньи и ее подготовка к изоляции клеток.
- Использование коллагеназы для ферментативного переваривания базальной мембраны.
- Применение центрифугирования для отделения эндотелиальных клеток от ткани.
- Ресуспендирование и культивирование изолированных клеток в подходящих средах.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных эндотелиальных клеток аорты свиньи.
- Клетки прикрепились к культуральным флаконам и продемонстрировали пролиферацию.
- Протокол оптимизирован для минимизации контаминации и обеспечения высокого выхода клеток.
- Предоставлены подробные этапы для обеспечения воспроизводимости в исследовательских условиях.
Выводы
- Описанный метод эффективен для выделения эндотелиальных клеток из аорты свиньи.
- Обеспечивает высокую степень чистоты и жизнеспособности клеток для последующих экспериментов.
- Может быть адаптирован для аналогичных исследований других сосудистых тканей.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Выделение первичных эндотелиальных клеток из аорты свиньи обеспечивает физиологически релевантную модель для изучения биологии сосудов и эндотелиальной дисфункции в доклинических исследованиях. Данный метод способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков, обеспечивая воспроизводимый доступ к нативным эндотелиальным фенотипам для разработки анализов и скрининга соединений. Акцент протокола на чистоте и жизнеспособности клеток повышает прогностическую достоверность на ранних этапах исследовательского процесса.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать специфические эндотелиальные пути и функции терапевтических мишеней в нативном клеточном контексте.
- Практическая ценность: обеспечивает получение очищенной популяции клеток, что снижает влияние побочных сигналов от неэндотелиальных примесей.
- Стратегическая ценность: способствует валидации мишеней на основе гипотез с более высокой биологической релевантностью по сравнению с иммортализованными линиями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить эндотелиальные клетки, пригодные для функциональных анализов по определению целостности барьера, миграции и воспалительных реакций.
- Практическая ценность: стандартизированный протокол выделения способствует воспроизводимости результатов в различных экспериментах и лабораториях.
- Стратегическая ценность: обеспечивает готовность анализа для скрининга соединений, нацеленных на сосудистые мишени.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Предлагает релевантную заболеванию систему для моделирования активации и дисфункции эндотелия при сердечно-сосудистых патологиях.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность длительного культивирования и пассирования для продолжительных доклинических исследований.
- Стратегическая ценность: Способствует трансляционному поиску биомаркеров и изучению механизмов действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод изоляции вписывается в непрерывный цикл исследований — от валидации мишени и разработки анализа до доклинической оценки, обеспечивая возобновляемый источник первичных эндотелиальных клеток для итерационного тестирования.
- Биология открытий: Обеспечивает возможность механистического исследования эндотелиальных мишеней и модуляции путей передачи сигнала.
- Скрининг: Позволяет получать стандартизированные жизнеспособные клетки для стабильного профилирования ответа на исследуемые соединения.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку таких показателей, как продукция оксида азота, проницаемость и экспрессия молекул адгезии.
- Трансляционные исследования: Связывают результаты in vitro с патофизиологией сосудов благодаря использованию клеток с сохраненным фенотипом.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для оценки сосудистых мишеней в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность выбора мишени за счет использования первичных клеток, сохраняющих нативные характеристики эндотелия.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря четко определенным этапам ферментативного переваривания и промывки.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет снижения количества ложноположительных результатов, вызванных артефактной активацией клеток.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию сосудистых мишеней с учетом рисков на основе физиологически релевантных данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями в асептических условиях и владение методами ферментативной диссоциации.
- Необходимо наличие коллагеназы IV и оборудования для инкубации с контролируемыми параметрами.
- Требуется соблюдение стандартизированных протоколов промывки и центрифугирования для обеспечения чистоты клеточной фракции.
- При адаптации метода для сосудов разного размера или разных видов животных требуется оптимизация условий.
- Метод ограничен доступностью свежей ткани аорты свиньи и необходимостью своевременной обработки после забора материала.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты
Похожие видео
0 Просмотры
Одновременная изоляция высококачественных кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов от сердца взрослых крыс
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение клапанные эндотелиальных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция аорты свиней: хирургическая процедура по удалению грудной аорты у миниатюрных свиней для последующего анализа
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами
Похожие видео
0 Просмотры
Оценка антикоагулянт и противовоспалительных свойств эндотелиальных клеток с использованием 3D клеточной культуры и не антикоагулянтом цельной крови
Похожие видео
0 Просмотры
Урожай эндотелиальных клеток от всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров после катетеризации правых отделов сердца
Похожие видео
0 Просмотры
Изоляция и культура первичных аортальных эндотелиальных клеток от миниатюрных свиней
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026