Энциклопедия экспериментов JoVE
Биология
0 просмотров • 3:15 мин. • July 8th, 2025
Витрификация эмбрионов — это метод сверхбыстрой криоконсервации, который охлаждает эмбрионы с чрезвычайно высокой скоростью до сверхнизких температур, способствуя их долгосрочному хранению.
Для начала возьмите заготовленные эмбрионы кролика в подходящую среду. Инкубируют эмбрионы с уравновешивающим раствором, содержащим низкие концентрации проникающих в клетки криопротекторов - этиленгликоля, или ЭГ, и диметилсульфоксида, или ДМСО. EG и ДМСО диффундируют через клеточные мембраны, замещая молекулы воды внутри клеток и предотвращая внутриклеточное образование кристаллов льда.
Затем инкубируйте эмбрионы с раствором для витрификации, содержащим более высокие концентрации EG и ДМСО, чтобы обеспечить адекватное проникновение криопротекторов и достаточный внутриклеточный отток воды, защищающий клетки от повреждения замораживанием.
Соедините стерильный криогенный держатель для соломинок с микродозатором. С помощью микродозатора заполните соломинку нужным материалом до нужного уровня. Затем аспирируют пузырь воздуха, за которым следует минимальный объем раствора для витрификации, содержащего эмбрион, и еще один пузырь воздуха.
Снова отсаживайте фильтрующий материал до тех пор, пока первая фракция не намокнет и не полимеризует ватную пробку с порошковым покрытием, запечатывая конец соломинки. Другой конец закройте гидрофобной соломинкой. Воздушные и срединные сегменты помогают изолировать эмбрионы внутри закрытого носителя.
Кратковременно погрузите соломинку в жидкий азот при температуре -196°C. Носитель обеспечивает высокую скорость охлаждения, затвердевая эмбрионы в стекловидную аморфную фазу, в то время как малый объем раствора витрификации и используемых криопротекторов смягчает осмотический стресс. Витрифицированные эмбрионы, при этом метаболическая активность приостановлена, могут храниться до использования.
Для витрификации эмбрионов следует погрузить эмбрионы в уравновешивающий раствор на 2 минуты, после чего следует 1-минутная инкубация в растворе для витрификации. В конце инкубации загрузите эмбрионы в пластиковую мини-трубочку объемом 125 микролитров и соедините закрытый конец соломинки с подходящим микродозатором объемом 1 миллилитров. Отсадите основание на середину до одной трети длины соломинки, за которым следует небольшой пузырь воздуха.
Затем с помощью стереомикроскопа отсасывайте эмбрионы в 40 микролитрах раствора для витрификации, а затем добавьте еще один небольшой пузырь воздуха в щелочной среде, достаточной для перемещения первой жидкой фракции вверх к хлопковому концу министроу. Затем закройте открытый конец министропы пробкой-соломинкой, погрузите министрогу непосредственно в жидкий азот для достижения остеклования и храните министроу в дьюаре с жидким азотом.