Редактирование генома на основе нуклеазы цинковых пальцев: метод модификации генома в плюрипотентных стволовых клетках человека с помощью механизма репарации, зависящей от двухцепочечной гомологии

Нуклеаза цинкового пальца или ZFN содержит стабилизированный ионами цинка, связывающий ДНК-связывающий макродомен, соединенный с эндонуклеазным доменом через линкер. Такая структура помогает сохранить специфичность при разрезании ДНК.

Чтобы использовать ZFN для редактирования генома, возьмите культуру плюрипотентных стволовых клеток человека. Дополните его плазмидой с кодировкой ZFN. Добавьте репарирующую плазмиду, содержащую ген-мишень и ген устойчивости к антибиотикам, зажатые между гомологическими группами или HA. Электропорируйте смесь клетки и ДНК, где электрический ток способствует проникновению плазмид внутрь клетки.

Оказавшись внутри, мотивы цинковых пальцев транслируемого ZFN связываются с триплетами комплементарных пар оснований в геноме хозяина, правильно позиционируя эндонуклеазу рестрикции Fok-1 в целевом центре. ZFN связываются с противоположными цепями попарно, что позволяет гомодимеризации Fok-1 образовывать активный каталитический центр, в котором Fok-1 генерирует двухцепочечные разрывы ДНК или DSB, создавая четырехнуклеотидный выступ.

Присутствие ГК в плазмиде репарации направляет гомологически зависимую репарацию, при которой нависающий конец инвертируется и использует гомологичную последовательность ГК в качестве матрицы. Синтез ДНК продолжается путем добавления нуклеотидов, комплементарных гену-мишени.

Образовавшиеся промежутки лигируют, облегчая вставку генов. Кроме того, ген устойчивости к антибиотикам без промотора экспрессируется промотором хозяина выше места введения. Успешно отредактированные клетки растут в среде отбора антибиотиков.

Начните с культивирования человеческих плюрипотентных стволовых клеток в среде hESC на 6-луночном планшете, содержащем митомицин С-инактивированный эмбриональный фибробласт мыши, или MEF, фидерные клетки, выращенные на желатине. Каждый последующий день после осаждения, пока hPSC не достигнет 50% конфлюенции, используйте стеклянную пипетку и вакуум для удаления всего объема среды. Замените на 3 миллилитра теплой среды hESC на лунку.

За сутки до нацеливания удалите среду hESC и добавьте свежую предварительно подогретую среду hESC с добавлением 10 микромоляра Y27632. Кроме того, приготовьте от одного до двух 6-луночных планшетов с лекарственно-устойчивыми фидерными клетками MEF от мышей DR4. В день нацеливания приготовьте растворы для трансфекции, пипетируя 5 мкг плазмид 1 и 2 экспрессии нуклеазы цинкового пальца в 1,5-миллилитровую пробирку.

Добавьте 30 микрограммов донорской плазмиды для восстановления, а затем достаточное количество фосфатного буферного раствора, чтобы довести объем до 300 микролитров. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в 50% конфлюенции. Далее с помощью стеклянной пипетки пылесосом удалите среду с пластины hPSCs. Затем промойте клетки 2 миллилитрами теплого 1X PBS. После аспирации PBS добавьте 0,5 миллилитра 0,25% раствора трипсина ЭДТА, непосредственно на клетки.

Поместите в инкубатор для тканевых культур примерно на 10 минут или до тех пор, пока питательный слой не начнет отрываться от пластины. После инкубации добавьте по 2 миллилитра теплой среды esWash в каждую лунку, чтобы остановить реакцию трипсина. Соберите ячейки из каждой лунки, следя за тем, чтобы подающие ячейки оторвались как лист. Пипеткой наденьте содержимое каждой лунки в одну 50-миллилитровую коническую пробирку, объединив все лунки, и растирайте клетки с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки.

Добавьте фильтрующий материал esWash, чтобы довести суспензию ячейки до 40 миллилитров. Подождите одну-две минуты, чтобы большие куски кормушки осядли на дне пробирки, затем удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки и поместите ее в свежую 50-миллилитровую коническую трубку. После центрифугирования клеточной суспензии в течение пяти минут при 190 х g аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах 1X PBS.

Соедините ресуспендированные клетки с приготовленным ранее раствором для трансфекции плазмы. Пипеткой соедините клетки и трансфекционную смесь в 4-миллиметровую электропорационную кювету и положите на лед на три-пять минут. Установите параметры экспоненциальной программы на системе электропорации на 250 вольт, 500 микрофарад, бесконечное сопротивление и размер кюветы 4 миллиметра. Электропорируйте клетки, а затем поместите кювету обратно на лед на три минуты.

Ресуспендируйте электропорированные элементы в 18 миллилитрах теплой среды hESC с добавлением 10 микромоляров Y27632. Осмотрите DR4 MEF под микроскопом. Поместите по 3 миллилитра одноклеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего питающие клетки DR4, и верните в инкубатор. На третий день после нанесения покрытия замените среду на элементах на среду hESC без Y27632. На 4 день замените невосполненную среду на среду, содержащую соответствующий антибиотик выбора. Здесь используется пуромицин.