Редактирование генома на основе нуклеазы цинковых пальцев: метод модификации генома в плюрипотентных стволовых клетках человека с помощью механизма репарации, зависящей от двухцепочечной гомологии

Нуклеаза цинкового пальца или ZFN содержит стабилизированный ионами цинка, связывающий ДНК-связывающий макродомен, соединенный с эндонуклеазным доменом через линкер. Такая структура помогает сохранить специфичность при разрезании ДНК.

Чтобы использовать ZFN для редактирования генома, возьмите культуру плюрипотентных стволовых клеток человека. Дополните его плазмидой с кодировкой ZFN. Добавьте репарирующую плазмиду, содержащую ген-мишень и ген устойчивости к антибиотикам, зажатые между гомологическими группами или HA. Электропорируйте смесь клетки и ДНК, где электрический ток способствует проникновению плазмид внутрь клетки.

Оказавшись внутри, мотивы цинковых пальцев транслируемого ZFN связываются с триплетами комплементарных пар оснований в геноме хозяина, правильно позиционируя эндонуклеазу рестрикции Fok-1 в целевом центре. ZFN связываются с противоположными цепями попарно, что позволяет гомодимеризации Fok-1 образовывать активный каталитический центр, в котором Fok-1 генерирует двухцепочечные разрывы ДНК или DSB, создавая четырехнуклеотидный выступ.

Присутствие ГК в плазмиде репарации направляет гомологически зависимую репарацию, при которой нависающий конец инвертируется и испо