Загрузка гранул для введения нуклеиновых кислот в адгезивные культивируемые клетки: метод загрузки флуоресцентных белков-кодирующих плазмид в адгезивные клетки млекопитающих

Начните с культивирования адгезивных клеток млекопитающих в культуральной тарелке. Переносите стерилизованные обработанные щелочью стеклянные шарики микронного размера в камеру специализированного загрузчика бисера. Закройте отверстие камеры сеткой с отверстиями оптимального размера, чтобы борта могли проходить через него во время загрузки. Закрепите сетку узлом камеры визуализации.

Извлеките носитель из пластины. Пипеткой введите в планшет суспензию флуоресцентного репортерного белка, кодирующего плазмидную ДНК для равномерного распределения по клеткам. С помощью аппарата загрузчика швов аккуратно диспергируйте монослой стеклянных шариков по ячейкам. Коротко постучите по тарелке с подходящим усилием.

Стеклянные шарики ненадолго скатываются поверх адгезивных клеток, в то время как обработка щелочью делает их менее прилипшими к клеткам. Воздействие столкновений между шариками и клетками передает адекватную деформацию, создавая локализованные нарушения в клеточных мембранах. Эти образованные переходные поры небольших размеров способствуют поглощению плазмидной ДНК в клетках, предотвращая попадание крупных гранул.

В период восстановления клеточная мембрана восстанавливается, восстанавливая целостность мембраны и захватывая плазмидную ДНК. Добавьте в тарелку питательный материал и осторожно отсасывайте все видимые плавающие шарики из тарелки. Инкубируйте тарелку.

Успешно трансфицированные клетки, содержащие плазмидную ДНК, экспрессируют флуоресцентные репортерные белки, которые можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом.

Удалите среду из ячеек и аккуратно отсасывайте всю среду со всех краев камеры. Затем наклоните камеру примерно под углом 45 градусов и удалите оставшуюся каплю среды из центральной микролунки. Аккуратно направьте раствор для загрузки шариков пипеткой на стеклянную микролунку, расположенную в центре камеры.

С помощью устройства для загрузки шариков аккуратно диспергируйте монослой стеклянных шариков поверх ячеек. Следите за тем, чтобы бусины покрывали ячейки полностью. Сожмите патронник двумя пальцами. Поднимите его примерно на два дюйма и сильно опустите вниз, используя силу, примерно эквивалентную падению блюда с этой высоты.

Осторожно добавьте среду обратно в камеру, медленно нанося пипетирование на пластиковую сторону камеры. Отсасывайте любые плавающие шарики, не нарушая клетки. Вся процедура загрузки шариков должна быть выполнена относительно быстро, чтобы ячейки не пересыхали, когда они находятся без среды. Затем инкубируйте клетки в течение 0,5-2 часов в инкубаторе.