Доставка генов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса: метод доставки трансгенов и кардиакальной специфической экспрессии в модели грызунов

Рекомбинантный аденоассоциированный вирус, rAAV, представляет собой небольшой одноцепочечный ДНК-вирус, генетически модифицированный для нацеливания на определенный тип клеток и транспортировки его генетического груза в ядро клетки-хозяина для экспрессии генов.

Начните с удержания мышиного щенка, находящегося под криоанестезией. Простерилизуйте кожу задней части тела и подкожно введите вектор rAAV, несущий нужный трансген по кардиоспецифическому промотору. Переносчик всасывается в сосудистую систему и достигает отдаленных органов, в том числе сердца.

Здесь рекомбинантный вирус прикрепляется к поверхности кардиомиоцита и интернализуется через эндоцитоз в эндосому. Внутри эндосомы вирусный капсид частично распадается, обнажая вирусные литические белки. Этот белок индуцирует поры в эндосомальной мембране, через которые вектор попадает в цитоплазму.

Вектор перемещается по цитоплазматическим микротрубочкам и проникает через ядерную пору. Попадая в ядро, вирусный капсид распадается, чтобы высвободить свой геном. Одноцепочечная ДНК, несущая целевой ген, затем преобразуется в двухцепочечную ДНК.

После транскрипции ДНК произведенная мРНК перемещается в цитоплазму. Здесь мРНК подвергается трансляции, экспрессируя целевой белок в кардиомиоцитах. Наблюдайте за образцами тканей из разных органов под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить эффективность и тканевую специфичность доставки генов к сердцу.

После определения титра вируса по текстовому протоколу готовят рабочие растворы rAAV9 с титрами вируса 1-7 х 10¹² частиц на миллилитр. Для лечения новорожденных мышей используйте раствор rAAV9, чтобы предварительно наполнить инсулиновый шприц объемом 0,33 x 12,7 миллилитров иглой 29-го калибра 1/2 дюйма, избегая образования пузырьков воздуха.

После криоанестезии щенка держите его в одной руке большим и указательным пальцами. Затем промокните заднюю кожу щенка палочкой-тампоном, пропитанной 70% изопропиловым спиртом. Иглу шприца вводят в передне-дорсальную подкожную клетчатку животного под углом от 5 до 10 градусов перед введением от 50 до 70 микролитров раствора rAAV9.