Доставка нуклеиновых кислот с помощью нанолезвий: метод доставки комплекса Cas9-sgRNA к клеткам-мишеням с помощью вирусоподобных частиц

Нанолезвия представляют собой синтетические вирусоподобные частицы без инкапсулированного вирусного генетического материала, что делает их подходящими носителями чужеродного груза в клетки-хозяева. Эти нанолезвия сконструированы с использованием ретровирусного ядра вируса лейкемии мыши, окруженного липидной бислойной мембраной, полученной из эукариотических клеток-продуцентов, используемых для сборки нанолезвий in vitro.

Ядро содержит фермент Cas9 в комплексе с sgRNA, специфичной для последовательности генома-мишени. Основные белки окружены оболочечными белками, содержащими трансмембранный домен или ТМ, проходящий через липидный бислой. TM прикрепляется к внеклеточному гликопротеиновому поверхностному домену или SU, который выступает из бислойной оболочки.

Чтобы использовать нанолезвия для редактирования генов, возьмите культуру адгезивных клеток-мишеней и дополните ее раствором нанолезвия. В культуре выступающий SU нанолезвия распознает соответствующий рецептор на поверхности клетки-хозяина и связывается с ним. Это приводит к изменениям в структуре домена SU, облегчая его выпуск.

Эти изменения вызывают конформационные изменения в ТМ-домене, который затем связывается с мембраной хозяина. Это связывание приближает нанолезвие к клетке-хозяину, позволяя слиться мембране вирусного бислоя с мембраной хозяина, и вирусное ядро перемещается в цитоплазму.

Оказавшись внутри клетки, ядро распадается, высвобождая комплекс Cas9-sgRNA, который может выполнять редактирование генома в своем целевом участке.

Для трансдукции клеток-мишеней нанолезвиями замените среду для культивирования клеток 500 микролитрами среды, содержащей очищенные нанолезвия. После четырех-шести часов инкубации клеток замените среду до нормального количества свежей среды.