Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:12 мин. • July 8th, 2025
Чтобы микроинъекции экзогенной ДНК в эмбрион Anopheles, возьмите нужное количество свежесобранных, предварительно бластодермных, яиц комаров. На этой ранней стадии развития яйцеклетка содержит ядра, не образуя клеточных структур.
Поместите яйца в форме лодочки на периферию влажной промокательной бумаги, присутствующей на поверхности предметного стекла. Этот этап обеспечивает достаточную гидратацию эмбриона для облегчения инъекции на последующих этапах. Выровняйте яйца рядом друг с другом так, чтобы их брюшная поверхность была открыта наружу.
Теперь возьмем узкую иглу для микроинъекций, содержащую желаемый раствор плазмиды. С помощью препарирующего микроскопа расположите иглу рядом с задним полюсом яйца — местом скопления предшественников зародышевых клеток. Введите иглу под соответствующим углом, чтобы она пронзила экзохорион - внешний слой - и эндохорион - внутренний слой яичной скорлупы - в конечном итоге достигнув эмбриона.
Введите плазмидную смесь в желток эмбриона. Аккуратно втяните иглу и дайте яйцам вырасти в подходящих условиях. По мере роста яйцеклетки некоторые ядра мигрируют к заднему полюсу, где они могут включать микроинъекционную ДНК. Эти ядра позже становятся гаметами — половыми клетками, которые могут привести к наследственным мутациям зародышевой линии.
Визуализируйте взрослых комаров по трансформированному фенотипу - наблюдаемым характеристикам в последующих поколениях, подтверждающим успешную микроинъекцию.
С помощью наконечника микрозагрузчика заполните иглы двумя микролитрами смеси ДНК. Вставьте иглу в иглодержатель и подсоедините трубку автоматического нагнетательного насоса. Выровняйте иглу так, чтобы она составляла угол 15 градусов с плоскостью предметного стекла.
Откройте кончик иглы, осторожно коснувшись первого яйца. Затем введите кончик иглы примерно на 10 микрометров в задний полюс. Успешная инъекция приведет к небольшому движению цитоплазмы внутри яйцеклетки.
С помощью коаксиального столика микроскопа перейдите к следующей яйцеклетке и продолжите инъекцию. Чтобы убедиться, что кончик иглы остается открытым и не был забит, нажмите кнопку «Инъекция» перед вводом еще одного эмбриона и визуализируйте маленькую каплю в отверстии иглы. Если игла засорилась, нажмите кнопку «Очистить», чтобы очистить иглу, и повторите тест на визуализацию капель.
При необходимости отрегулируйте давление, если отверстие кончика иглы становится немного больше, чтобы размер капель оставался маленьким. Введите от 40 до 50 яиц с помощью одной иглы. После того, как инъекции будут завершены, промойте яйца в стеклянную емкость, выстланную фильтровальной бумагой и заполненную 50 миллилитрами деионизированной воды.