Гидродинамическая доставка генов: метод экстрагенной ДНК in vivo в гепатоцитах мышей путем инъекции в хвостовую вену

Чтобы выполнить гидродинамический перенос генов, начните с использования шприца, наполненного раствором на основе физиологического раствора, содержащим рекомбинантные плазмиды, несущие интересующий ген. Затем возьмите мышиную модель и быстро введите большой объем раствора плазмиды у основания хвоста, обеспечивая внутривенное введение раствора плазмиды в хвостовую вену.

Инъекция большого объема плазмид под давлением создает механическую силу, называемую гидродинамической силой, которая увеличивает внутрисосудистое давление в нижней полой вене - вене, которая несет дезоксигенированную кровь к сердцу.

Большой объем жидкости вызывает застойные явления в правом желудочке сердца, что приводит к изменению направления крови. На этом этапе раствор плазмиды попадает в печеночную вену, которая переносит его в печень.

Плазмиды перемещаются внутри печеночных синусоид — пространств в печени, выстланных эндотелиальными клетками. Увеличенный объем крови помогает плазмидам проникать в эндотелиальный слой, помогая им достигать окружающих гепатоцитов – клеток печени.

Быстрый приток плазмидного раствора вызывает давление на клеточную мембрану гепатоцитов, порождая переходные поры. Эти поры облегчают поглощение клетками плазмидной ДНК. Позже мембранные поры закрываются, захватывая плазмиды внутри гепатоцитов.

Успешная экспрессия интересующего гена в гепатоцитах подтверждает трансфекцию.

Начните с взвешивания мышей, затем приготовьте стерильный физиологический раствор, содержащий 15 микрограммов на миллилитр векторной конструкции для ночного красавица без солевого эндотоксина и 1 микрограмм на миллилитр pc-HSB5, не содержащего эндотоксинов. Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы ввести каждой мыши объем, равный 10% от массы их тела. Наполните стерильный 3-миллилитровый шприц необходимым объемом для одной мыши, и прикрепите иглу 27-го калибра.

Добавив соответствующее количество папиросной бумаги, чтобы оставить минимальное пространство для движения, но достаточно места для дыхания, вставьте мышь в соответствующий ограничитель с отверстиями для дыхания. Согрейте хвост с помощью инфракрасной лампы в течение 30-60 секунд, при этом внимательно следите за признаками перегрева, такими как быстрое движение хвоста или другие признаки возбуждения, затем очистите хвост спиртовым тампоном.

Вставьте иглу почти горизонтально в одну из двух боковых хвостовых жилок, расположенных близко к основанию хвоста. При успешном введении небольшое количество крови может течь обратно в конус иглы. Введите весь объем в хвостовую вену в течение 8-10 секунд. После инъекции сразу же извлеките мышь из ограничителя. Компрессируйте рану от инъекций стерильной марлей не менее чем на 30 секунд или до тех пор, пока кровотечение не прекратится.

Успешная гидродинамическая инъекция в хвостовую жилу имеет решающее значение для трансфекции и особенно зависит от скорости, объема и времени инъекции. Чтобы облегчить внутривенную инъекцию, убедитесь, что мыши не испытывают стресса или обезвоживания в день инъекции.

После 30–60 минут одиночного содержания в клетке для восстановления перенесите мышь обратно в исходную клетку.