Опосредованная агробактериями генетическая трансформация: метод генетической трансформации генома риса с помощью генетически модифицированной агробактерии Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens, фитопатогенная бактерия, может быть генетически модифицирована путем введения искусственно приготовленной Ti-плазмиды, несущей ген, представляющий интерес в ее транспортной ДНК или Т-ДНК, и вспомогательной плазмиды, несущей гены вирулентности или Vir для переноса Т-ДНК в растительные клетки.

Для генетической трансформации, опосредованной агробактериями, начните с молодого соцветия риса и разрежьте его на мелкие кусочки. Перенесите черенки в питательную среду и инкубируйте, чтобы облегчить рост черенков в недифференцированную клеточную массу, называемую каллусом.

Теперь перенесите каллус в инфильтрационную среду для агробактерий, содержащую ацетосирингон - хемоаттрактант для агробактерий. Далее добавьте в среду культуру генетически модифицированной Агробактерии и коротко инкубируйте.

Молекулы ацетосиризона активируют белок клеточного рецептора - VirA - на мембране Agrobacterium, который в дальнейшем опосредует фосфорилирование белка-активатора транскрипции - VirG. Фосфорилированный VirG движется по направлению к хелперной плазмиде и активирует транскрипцию каскада генов вирулентности, включая белки канала и эндонуклеазы – VirD1 и VirD2.

Канальные белки образуют транспортный канал, соединяющий бактериальную и растительную клетки, в то время как эндонуклеазы связываются с пограничными последовательностями в плазмиде Ti и расщепляют Т-ДНК с VirD2, связанным на одном конце. После этого VirD2 направляет поступление Т-ДНК через транспортный канал в клетки каллуса и способствует ее интеграции в геном риса.

Протрите каждое соцветие 70% спиртовым тампоном, и дайте ему высохнуть перед срезкой. Принесите соцветие на стерильный лабораторный стол, и нарежьте его на небольшие кусочки стерилизованными ножницами. Затем переложите черенки в пластину Петри, содержащую среду NBD2.

Инкубируйте пластину в темноте при температуре 26 градусов Цельсия в течение 10-14 дней, чтобы вызвать каллус. Чтобы выполнить трансформацию, переведите одну колонию из планшета YEB с селективными антибиотиками в 5 миллилитров жидкой среды YEB, содержащей те же антибиотики, в 50-миллилитровую коническую стерильную пробирку. Встряхните пробирку на орбитальном вибростенде при температуре 250 x g и температуре от 25 до 28 градусов Цельсия, пока бактерии не вырастут до наружного диаметра₆₀₀ 0,5.

Добавьте 1 миллилитр бактериальной суспензии к 100 миллилитрам среды YEB с теми же селективными антибиотиками в коническую колбу объемом 250 миллилитров и встряхивайте колбу на орбитальном шейкере при температуре 250 х г и 28 градусах Цельсия в течение четырех часов. Центрифугируйте культуру при давлении 4000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы собрать бактерии. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу средой AAM-AS, и разбавьте суспензию наружным диаметром₆₀₀ 0,4.

После инкубации соберите около 150 здоровых светло-желтых эмбриогенных каллусов в стерильную колбу объемом 150 миллилитров. Добавьте в колбу от 50 до 75 миллилитров суспензии бактериальных клеток, а затем добавьте от 10 до 25 миллилитров свежей среды AAM-AS, погрузите каллусы на 10-20 минут, периодически встряхивая.

Осторожно вылейте бактериальную суспензию из колбы, а каллусы обсушите стерильной фильтровальной бумагой. Затем поместите их на чашку Петри со средой NBD-AS и накройте фильтровальной бумагой. Инкубируйте каллусы при температуре от 25 до 28 градусов Цельсия в темноте в течение трех дней, проверяя их на наличие избыточного бактериального роста.

После трех дней совместного выращивания переложите каллусы в стерильную чашку Петри с помощью фильтровальной бумаги, затем высушите их на воздухе в течение двух часов на чистой скамейке. Убедитесь, что каллусы не прилипли к фильтровальной бумаге, и перенесите их в первичную среду отбора NBD2.

Через две недели равномерно переложите каллусы на новую тарелку со свежей средой для отбора. Затем переместите каллусы в свежую среду MS для дифференцировки, а бутоны побегов в среду MS (с 10 мг/л гигромицина), чтобы размножить больше побегов.