Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:59 мин. • July 8th, 2025
Для доставки плазмидной ДНК на основе электропорации в клетки первичных нейронов начните с суспензии клеток в подходящей среде для электропорации. Добавьте флуоресцентную плазмидную ДНК, кодирующую белки, для приготовления электропорационной смеси.
Аккуратно переложите электропорационную смесь в кювету для электропорации, избегая образования пузырьков воздуха, которые могут негативно повлиять на эффективность электропорации. Перенесите кювету в держатель кюветы электропоратора; Задайте параметры электропорации. Инициируйте электропорацию.
Приложенные высоковольтные короткие электрические импульсы через клеточную мембрану вызывают дифференциальное накопление заряда по обе стороны мембраны, увеличивая трансмембранный потенциал, напряжение на клеточной мембране.
Когда индуцированный трансмембранный потенциал превышает потенциал пробоя липидного бислоя, липидный бислой дестабилизируется с локальным изменением конфигурации, образуя на клеточной мембране переходные гидрофильные поры. Поры соответствующего размера обеспечивают путь для проникновения плазмидной ДНК в цитоплазму клетки.
По завершении электропорации липидный бислой повторно герметизируется, восстанавливая целостность бислоя клеточной мембраны, тем самым захватывая плазмидную ДНК. Далее, во время фазы клеточного цикла, когда ядерная мембрана, двухслойная мембрана, окружающая ядро, разбирается, плазмидная ДНК перемещается в ядро.
Пластинчатая электропорация ячеек в средысодержащие лунки многолуночного планшета с покрытыми белком покровными стеклами. Инкубируйте, чтобы клетки могли прилипнуть к покрытому белком покровному стеклу. Успешно трансфицированные клетки, содержащие плазмидную ДНК, экспрессируют флуоресцентные белки.
Для начала добавьте 0,5 миллилитра питательной среды в каждую стенку 24-луночного планшета, содержащего покрытые покровные стекла, и держите ее в тепле при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом. Пипеткой наберите необходимое количество клеток в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров и вращайте при давлении 200 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах Opti-MEM. Повторите эту процедуру дважды, чтобы убедиться в отсутствии остатков питательной среды в пробирке. Установите параметры электропорации, как указано в списке. Аккуратно измельчите реакцию электропорации, чтобы хорошо перемешать, и используйте длинный наконечник пипетки P200, чтобы перенести точный объем 100 микролитров смеси в кювету с двухмиллиметровым зазором.
Как только кювета окажется внутри кюветной камеры, нажмите омега-кнопку электропоратора и запишите значение импеданса, придерживаясь точного объема 100 микролитров. Диапазон значений импеданса должен составлять примерно 30 и 35.
Нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить импульс. Запишите измеренные значения тока и камни, отображаемые на рамке для считывания. Извлеките кювету из камеры.
Немедленно добавьте в кювету 100 микролитров предварительно подогретой питательной среды, и повторно суспендируйте ее, пипетируя вверх и вниз два-три раза. Немедленно переложите клеточную суспензию на заранее подготовленную 24-луночную пластину. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом.