Инъекция перивителлина на основе лентивирусного вектора: метод трансдукции интересующего гена в оплодотворенные одноклеточные ооциты мыши

Для проведения трансфекции берут специализированную камеру, содержащую свежеоплодотворенные яйцеклетки мыши, взвешенные в капле соответствующей среды. На этой стадии яйцеклетка содержит большой центральный ооцит, содержащий как отцовские, так и материнские пронуклеусы.

Ооцит покрыт богатой гликопротеином пеллюцидой зоной, окруженной плотно расположенными кластерами кучевых клеток, встроенных во внеклеточный матрикс, богатый гиалуроновой кислотой. Теперь обработайте яйца ферментом гиалуронидаза, который переваривает гиалуроновую кислоту. Это приводит к диссоциации кумулюсных клеток, в конечном итоге обнажая пеллюцидную зону, окружающую ооцит.

Поместите один обработанный ооцит рядом с кончиком пипетки и приложите давление всасывания, чтобы зафиксировать его положение. Возьмем узкую иглу для микроинъекций, содержащую сконструированную суспензию лентивирусного вектора, несущую трансген, инкапсулированный в вирусную оболочку. Эти ретровирусы обладают присущей им способностью интегрироваться в геном хозяина.

Далее прокалывайте иглу через zona pellucida, чтобы добраться до перивителлинового пространства – пространства между самой внешней zona pellucida и самой внутренней плазматической ме