Лазерная доставка генов лентивируса: метод пермеабилизации оплодотворенных яйцеклеток мышей для облегчения доставки генов лентивирусов

Лазерная доставка лентивирусных генов — это метод переноса трансгена в систему хозяина.

Чтобы получить трансгенных мышей, начните с выделения оплодотворенных мышью яйцеклеток в подходящей питательной среде. Поместите оплодотворенную яйцесодержащую культуральную чашку на предметный столик микроскопа, предварительно установленный лазерным аппаратом и подключенный к управляющему программному обеспечению. Наблюдайте при подходящем увеличении.

Оплодотворенные яйца окружены zona pellucida, защитным слоем гликопротеина, который блокирует лентивирусные частицы. Чтобы проникнуть через этот барьер, включите лазерный аппарат и убедитесь, что лазерный светодиод виден над прозрачной зоной. С помощью управляющего программного обеспечения выстрелите лазером. Отрегулируйте продолжительность обжига в соответствии с желаемым диаметром перфорации.

Поместите яйца в инкубатор для восстановления. После короткой инкубации удалите яйца и добавьте частицы лентивируса, несущие интересующий ген и флуоресцентный селективный маркер.

При перфорации zona pellucida лентивирус легко диффундирует к мембране яйцеклетки и проникает через эндоцитоз. Лентивирус распадается, высвобождая свою РНК, которая при последовательной переработке в двухцепочечную ДНК попадает в ядро хозяина, интегрируя чужеродные гены в геном хозяина.

Инкубируйте яйца и дайте им развиться в бластоцисты. Имплантируйте бластоцисты спаренным самкам мышей. После завершения беременности восстановите щенков и проанализируйте их на наличие трансгенов.

Пока яйца находятся в инкубаторе, настройте и откалибруйте лазер XYClone в соответствии с рекомендациями производителя. Когда яйца будут готовы, поместите первую капельную пластину на предметный столик лазерного микроскопа и вручную сфокусируйте зону пеллюциды. Убедившись, что лазерный светодиодный свет виден через объектив, переместите предметный столик микроскопа, чтобы нацелиться на зону с помощью светодиодного лазера, и используйте компьютерное программное обеспечение, чтобы установить лазер XYClone на 250 микросекунд.

Отрегулируйте размер светодиодной лампы до соответствующих размеров и трижды перфорируйте зону пеллюциды каждого яйца лазером, чтобы получить три отверстия по 10 микрометров.

Очень важно выполнить перфорацию быстро, но осторожно, так как оплодотворенные яйца не могут оставаться вне инкубатора дольше 15 минут.

Затем, верните продырявленные яйца в инкубатор еще на два часа. В конце второй инкубации обработайте 50-микролитровую каплю КСОМ 2 микролитрами концентрированного лентивируса без смешивания, и верните яйца в инкубатор на четверо суток. Когда яйцеклетки разовьются в бластоцисты, используйте нехирургическое устройство для переноса эмбрионов, чтобы поместить примерно от 10 до 15 эмбрионов и около 2 микролитров КСОМ.

Через 17 дней после переноса эмбрионов дайте беременной мыши родить естественным путем или при необходимости соберите новорожденных с помощью кесарева сечения.