Биолистический-опосредованный перенос генов: метод доставки интересующего гена в клетки-мишени с помощью биолистической генной пушки

Начните с оптимального объема золотых бусин - биологически инертных и нетоксичных носителей доставки генов - в микроцентрифужной пробирке. Затем добавьте катионные агенты - спермидин и хлорид кальция, а затем желаемые фрагменты ДНК к золотым бусинам. Аккуратно переверните трубку и инкубируйте.

Хлорид кальция связывается с фрагментами ДНК и облегчает их покрытие золотых бусин остатками спермидина. Далее центрифугируйте и удалите растворитель. Ресуспендируйте покрытые ДНК шарики в этаноле. Аккуратно нанесите шарики на стерильный макроноситель. Дайте ему высохнуть.

Создание биолистической генной пушки, состоящей из ускорительной трубки газообразного гелия и бомбардировочной камеры с разрывной мембраной и стопорным экраном в соответствующих слотах. Далее переверните макронесущую мембрану и загрузите ее ниже разрывной мембраны.

После этого культивируемые клетки-мишени хозяина помещают в подходящую твердую среду с добавлением сорбита - осмотического стабилизатора для повышения эффективности трансформации. Как только установка будет готова, выстрелите из генной пушки.

По мере того, как гелий движется вниз по ускорительной трубке, давление продолжает нарастать до тех пор, пока разрывная мембрана не сломается, создавая гелиевые ударные волны. Эти ударные волны приводят в движение макронесущий диск, несущий золотые шарики, к останавливающему экрану, который пропускает только золотые шарики.

Ускоренные золотые шарики проникают в ядро клетки-хозяина, интегрируя желаемую ДНК в геном клетки-хозяина.

Начните с использования щипцов для погружения оранжевых макроносителей биолистических дисков в 100% этанол, затем перенесите диски в большую чашку Петри, содержащую дриерит, следя за тем, чтобы диски не касались влагопоглотителя. После высыхания вдавите диски в серебряные держатели для дисков, протертые этанолом, затем смочите трубку с золотыми бусинами и добавьте 12 микролитров раствора шариков в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров за одно превращение.

Далее последовательно добавьте 2 микрограмма ДНК, 10 микролитров хлорида кальция и два микролитра свободного основания спермидина в каждую трубку с шариками. Затем окуните каждый образец в вихрь, инкубируйте пробирки при температуре окружающей среды в течение 5 минут, время от времени осторожно поворачивая, чтобы снова суспендировать осевшие шарики.

В конце инкубации очистите золотые шарики, покрытые ДНК, и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Медленно полностью суспендируйте шарики в 600 микролитрах 100% этанола, затем снова гранулируйте ячейки, на этот раз суспендируя шарики в 8 микролитрах этанола.

Теперь выложите каждую трубку с бусинами на центр отдельного биолистического диска кругами диаметром 1 сантиметр. Если присутствует достаточная концентрация бусин, то после того, как бусины высохнут, в центре каждого диска будет виден золотой круг.

Чтобы запустить генную пушку, сначала включите вакуумный насос, затем поверните ручку гелиевого бака против часовой стрелки, пока на манометре не будет достигнуто давление примерно 2200 фунтов на квадратный дюйм. Затем поверните левый красный переключатель, чтобы включить генную пушку, и отрегулируйте скорость потока для вакуума и вентиляционного отверстия так, чтобы вакуум достиг 28 дюймов ртутного столба в течение 15 секунд. Убедитесь, что расстояние между разрывным диском и макроносителем в это время также составляет примерно 3/8 дюйма.

Когда все будет на месте, протрите всю камеру 70% этанолом и погрузите разрывные мембраны в 100% этанол. Высушив диски на стерильной поверхности, с помощью динамометрического ключа ослабьте держатель разрывного диска и вставьте чистый диск. Закрутите держатель разрывного диска на место и поверните его один раз вправо с помощью динамометрического ключа, чтобы затянуть его.

Далее погрузите сетчатые сита в 100% этанол. После высыхания поместите экран на белую пластиковую монтажную пластину и поместите держатель диска макроносителя стороной ДНК вниз в камеру диска. Закрутите серебряный колпачок и поместите монтажную пластину в самый высокий слот, затем поместите агаровую пластину YPD, содержащую 1 моляр сорбита, на нижнюю пластину.

Теперь закройте дверцу камеры и зафиксируйте ее на месте, затем нажмите и удерживайте средний красный переключатель в верхнем положении, чтобы включить вакуум и позволить ему достичь 28 дюймов ртутного столба. Как только будет достигнут надлежащий уровень вакуума и средний переключатель будет переведен в нижнее положение, нажмите правый красный переключатель для срабатывания.

Когда разрывная мембрана лопнет, немедленно отпустите кнопку огня и нажмите средний красный переключатель в среднее положение, чтобы стравить патронник до 0 фунтов на квадратный дюйм. Если выстрел был удачным, на пластине будет видно золотое кольцо. Очистите разрывную мембрану и мусор макронесущей мембраны и выключите генную пушку, затем поверните ручку гелиевого бака по часовой стрелке, чтобы выключить газ и выключить вакуумный насос.