Энциклопедия экспериментов JoVE
Биологические методы
0 просмотров • 3:43 мин. • July 8th, 2025
Начните с флуоресцентной плазмидной ДНК, кодирующей белки, или суспензии пДНК в среде. Добавьте биосовместимые магнитные наночастицы, покрытые катионным полимером, в суспензию пДНК и инкубируйте.
Положительно заряженные катионные полимеры электростатически взаимодействуют и сопрягаются с отрицательно заряженной пДНК, что приводит к конденсации пДНК и образованию «магнитных полиплексов» с общим положительным зарядом.
Теперь перенесите смесь полиплекса в многолуночный планшет, содержащий адгезивную культуру первичных нейрональных клеток мыши. Установите многолуночный планшет на магнитную пластину и инкубируйте.
Магнитное поле, создаваемое магнитной пластиной, приводит к тому, что полиплексы оседают и накапливаются на поверхности нейронных клеток. Этот тесный контакт с поверхностью клетки способствует неспецифическому связыванию положительно заряженных полиплексов с отрицательно заряженными протеогликанами, ассоциированными с клеточной мембраной.
Впоследствии полиплексы интернализуются с помощью эндоцитоза – процесса, при котором локальные участки клеточной мембраны инвагинируются и отщипываются с образованием связанных с мембраной везикул, называемых эндосомами.
Внутри цитоплазмы катионные полимеры полиплекса индуцируют накопление протонов в эндосоме. Одновременный приток ионов хлора для поддержания нейтральности заряда увеличивает эндосомальную ионную силу, что приводит к притоку воды.
В конце концов, эндосомы набухают и разрываются из-за осмотического давления, высвобождая полиплексы в цитоплазму. Конденсированная пДНК внутри полиплексов способствует повышению цитозольной подвижности, в то время как катионные полимеры защищают пДНК от деградации цитоплазматической нуклеазы.
После диссоциации полиплексов высвобожденная пДНК - во время соответствующей фазы клеточного цикла, когда ядерная мембрана временно распадается - перемещается в ядро. Клетки, успешно трансфицированные пДНК, экспрессируют флуоресцентные белки.
Чтобы культивировать моторные нейроны, разбавляют их до 5000-10000 клеток в 500 микролитрах питательной среды на лунку в 24-луночном планшете. Затем удалите раствор ламината с помощью наконечника для дозатора P1000. Разведенные в питательной среде моторные нейроны следует немедленно перенести на пластины покрытия во избежание высыхания.
Чтобы получить ДНК, ресуспендируйте 1 микрограмм ДНК в 50 микролитрах питательной среды нейронов и сделайте вихрь в течение 5 секунд. Чтобы приготовить трубку для бусин, ресуспендируйте 1,5 микролитра бусин в 50 микролитрах питательной среды для нейронов. Добавьте 50 микролитров раствора гранул к 50 микролитрам раствора ДНК и инкубируйте 20 минут при комнатной температуре.
Во время этой инкубации извлеките 100 микролитров питательной среды из лунки, которая будет трансфицирована. Затем перенесите по 100 микролитров смеси ДНК-шариков в каждую лунку и инкубируйте 24-луночный планшет от 20 до 30 минут на магнитной пластине при температуре 37 градусов Цельсия.