Ретровирусная опосредованная трансдукция генов: метод переноса генов для доставки трансгена в культивируемые клетки с использованием сконструированных ретровирусных векторов

Чтобы трансдуцировать клетки-хозяева с РНК, содержащими ретровирусные векторы, возьмите пробирку, содержащую упакованные векторы в подходящих средах. Каждый вектор содержит вирусный капсид, содержащий комплемент РНК трансгена, который должен быть интегрирован в геном хозяина и важные вирусные ферменты. Липидный бислой окружает капсид для облегчения проникновения в клетку-хозяина.

Добавьте векторы в присутствии подходящего реагента для трансфекции в лунку культивального планшета, содержащего суспензию клетки-хозяина. Накройте тарелку. Центрифугируйте на низкой скорости, чтобы обеспечить спиновую трансдукцию. Это приближает вирусный вектор к поверхности клетки-хозяина, повышая эффективность трансдукции.

В то же время поликатионы в реагенте для трансфекции нейтрализуют отрицательные заряды вируса и клетки-хозяина, способствуя адсорбции вируса на клетках-мишенях.

Следовательно, рецепторы на поверхности вируса способствуют его слиянию с мембраной хозяина. Вирусный капсид проникает в клетку и разрывается, высвобождая трансгенную РНК и вирусные ферменты в ее цитоплазму.

Внутри цитоплазмы вирусная обратная транскриптаза преобразует РНК в одноцепочечную комплементарную ДНК, а затем превращает ее в двухцепочечную провирусную ДНК. Полученная ДНК попадает в ядро. Фермент вирусная интеграза опосредует интеграцию провирусной ДНК в геном хозяина, в результате чего образуются трансдуцированные клетки.

Соберите свежий вирусный надосадочный слой из клеточной линии-продуцента вируса. На этом этапе клетки должны быть хорошо расположены друг от друга с определенной морфологией. Далее осторожно отасуньте верхние 2 миллилитра среды из каждой лунки 6-луночного планшета, содержащего клетки костного мозга. Избегайте аспирации клеток костного мозга, которые обычно сосредоточены в середине лунки.

Добавьте по 3 миллилитра свежедобавленной вирусной надосадочной жидкости в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего клетки костного мозга. После упаковки пластин в пластик повторите отжимную трансдукцию, а затем поместите развернутые пластины в инкубатор для тканевых культур. Через 24 часа на третий день удалите и замените 2 миллилитра среды из лунок.