JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 2:44 мин • July 8th, 2025
Стеатоз печени – патологическое состояние, характеризующееся чрезмерным накоплением жиров в гепатоцитах – ярко выраженном типе клеток печени. Жиры откладываются в виде липидных капель различного размера в цитоплазме гепатоцитов.
Структурно липидная капля содержит ядро нейтральных гидрофобных жиров, таких как триглицериды и эфиры холестерина. Ядро окружено фосфолипидным монослоем, украшенным различными белками.
Чтобы визуализировать отложение жира, возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивную культуру гепатоцитов. Клетки предварительно обрабатываются стеатогенной средой, чтобы индуцировать накопление липидных капель внутри них.
Добавьте нужную концентрацию параформальдегида, который диффундирует в клетки и сшивает белки. Этот этап деактивирует протеазы и сохраняет структуру гепатоцитов. Выбросьте параформальдегид и добавьте раствор Oil-red-O, содержащий органический краситель, растворенный в изопропаноле.
Изопропанол действует как растворитель-носитель для труднорастворимых молекул Oil-red-O. Это помогает молекулам красителя проникать в фиксированные гепатоциты и в конечном итоге достигать липидных капель. Попадая внутрь, краситель переходит от изопропанола к нейтральным липидам благодаря своему более высокому сродству, образуя краситель-липидный комплекс. Это приводит к красной окраске липидных капель.
Откажитесь от излишков красителя и понаблюдайте за клетками под микроскопом. Внутриклеточные липидные капли имеют интенсивный красный цвет.
Поместите покровную крышку клеточной культуры в каждую лунку в 24-луночный планшет и засейте клетки HepG2, как описано в текстовой рукописи. После соответствующей инкубации промойте клетки 1 миллилитром PBS, а надосадочную жидкость выбросьте. Зафиксируйте их 1 миллилитром 4% параформальдегида в PBS, и выдержите 1 час при комнатной температуре. Откажитесь от излишков параформальдегида, а клетки промойте 1 миллилитром дистиллированной воды.
Затем добавьте 1 миллилитр 70% изопропанола, и выдерживайте в течение 5 минут. Выбросьте избыток изопропанола, добавьте 1 миллилитр раствора Oil-red O и выдерживайте в течение 30 минут. Слейте излишки раствора Oil-red O, а затем смойте 1 миллилитром дистиллированной воды. Наблюдайте за клетками под микроскопом при увеличении в 400 раз.