Окрашивание гладкомышечных клеток сосудов аорты по методу фон Косса: методика in vitro для оценки кальцификации медиального слоя артерии

Сосудистые гладкомышечные клетки, или VSMC, являются заметными клеточными компонентами в оболочке - среднем слое стенки кровеносного сосуда. В ответ на патологические сигналы или старение эти клетки опосредуют кальцификацию сосудов – явление накопления кальция во внеклеточном матриксе.

Возьмите многолуночный планшет, содержащий адгезивный слой предварительно кальцинированной культуры VSMC мышиной аорты. Инкубируйте клетки с раствором формалина для сшивания клеточных белков и стабилизации структуры VSMC перед окрашиванием.

Начните окрашивание фон Косса с аспирации формалина из лунки и добавления раствора нитрата серебра. Инкубируйте тарелку под подходящим источником света.

Как только раствор нитрата серебра достигает мест кальцификации во внеклеточном матриксе слоя VSMC, ионы серебра заменяют ионы кальция, связанные с фосфатами. Это приводит к переходной желтой окраске. В присутствии органических веществ и света фотохимическое разложение фосфата серебра приводит к образованию металлического серебра черного цвета.

Выбросьте максимальное количество отработанного раствора нитрата серебра. Обработайте клетки раствором тиосульфата натрия. Этот раствор преобразует остаточные соли серебра в водорастворимый комплекс, который может быть удален путем окончательного промывки водой, улучшая контраст окрашивания.

Визуализируйте окрашенные клетки, чтобы обнаружить нерастворимые черные отложения, указывающие на кальциноз.

Чтобы вызвать кальцификацию в гладкомышечных клетках сосудов, перенесите клетки в культуральную пластину с шестью лунками и дайте им прилипнуть. Далее повторно скармливайте клетки в средах для кальцинования. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия не менее семи дней. После этого отсасывайте среду из клеточной культуральной пластины. Промойте клетки один раз в деионизированной воде.

Закрепите клетки, поместив в них 1 миллилитр 10% формалина комнатной температуры на 20 минут. Затем удалите формалин и промойте неподвижные клетки дистиллированной водой в течение 5 минут.

Затем инкубируйте клетки в 1 миллилитре 5% раствора нитрата серебра под лампой мощностью от 60 до 100 Вт в течение 1-2 часов. После этого аспирируйте раствор нитрата серебра и промойте дистиллированной водой в течение 5 минут. Через 5 минут удалите непрореагировавшее серебро, поместив клетки в 1 миллилитр 5% раствора тиосульфата натрия в дистиллированную воду на 5 минут. Впоследствии промойте клетки дистиллированной водой в течение 5 минут. Клетки, окрашенные фон Косса, теперь готовы к визуализации с помощью стандартной микроскопии инвертированного света.