JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:50 мин • July 8th, 2025
Для негативного окрашивания оболочечных вирусов начните с нужной вирусной суспензии. Инкубируйте вирусы с глутаральдегидом, химическим фиксатором. При проникновении глутаральдегид сшивает вирусные белки и нуклеиновые кислоты, инактивируя вирусы, сохраняя при этом морфологию, тем самым способствуя безопасному обращению с вирусами. Переложите эту смесь в многолуночную пластину.
Прикрепите просвечивающие электронные микроскопы, ПЭМ, сетки, содержащие капсулу, к пипетке через соединитель. С помощью пипетки аспирируйте вирусфиксирующую смесь в капсулу. Инкубируйте дозатор в сборе, чтобы вирусы могли адсорбироваться на поверхностях сетки.
Выньте смесь. Промойте капсулу, удаляя неприлипшие вирусы и фиксаторы. Внесите пипеткой в капсулу раствор уранилацетата, красителя на основе тяжелых металлов. Инкубируйте для того, чтобы пятно контактировало с вирусами.
Ионы уранила связываются со специфическими мембранными гликопротеинами и фосфолипидами на поверхности вирусов. Ионы могут проникать в вирусы и связываться с нуклеокапсидными белками, содержащими геном. Это связывание индуцирует агрегацию и осаждение ионов тяжелых металлов вокруг вируса и конкретных вирусных структур.
Отделите капсулу. Удалите лишнее пятно с решеток и высушите на воздухе.
Во время ПЭМ-визуализации высокоэнергетические электронные пучки проходят через вирус, в результате чего электронно-плотные окрашенные области вируса рассеивают больше электронов. Тем не менее, общая низкая электронная плотность вируса позволяет электронам проходить. Система визуализации обрабатывает эти по-разному рассеянные электроны, создавая высококонтрастное изображение.
Вирусы с отрицательным окрашиванием выглядят светлее с темным нуклеокапсидом на темной границе, что облегчает визуализацию ультраструктуры.
Для начала смешайте вирусную суспензию с равным объемом 4% глутаральдегида, чтобы достичь конечной концентрации 2% глутаральдегида. Используя фиксатор, инактивируйте вирус не менее чем на 24 часа. Обеззаражьте трубку и перенесите ее в установку BSL2-EM.
После этого прикрепите к пипетке захватчик с сеткой. Аспирируйте смесь в капсулу. Положите пипетку на бок так, чтобы сетки были ориентированы горизонтально, на 10 минут.
Затем возьмите в руки пипетку и выбросьте вирусную смесь в контейнер для отходов. Отасывайте 40 микролитров деионизированной воды в капсулу, а затем утилизируйте воду в контейнер для отходов. Повторите эту стирку три раза.
После этого аспирируйте 40 микролитров 1% UA или 1% PTA в капсулу в течение 30 секунд. Извлеките капсулу из пипетки. Используя фильтровальную бумагу, высушите сетки промокательными средствами, затем дайте сеткам высохнуть на воздухе.