JoVE Encyclopedia of Experiments
Биологические методы
0 просмотров • 3:14 мин • July 8th, 2025
Для специфического окрашивания цитоплазмой клеток в микроокружении мягких тканей получают свежесобранную почку мыши. Обработайте его фиксирующим раствором, содержащим формальдегид, ледяную уксусную кислоту, метанол. Инкубируют при низких температурах.
Формальдегид проникает в клетки, сшивая белки с белками и белки с нуклеиновыми кислотами. Метанол вытесняет воду из тканей и свертывает белки. Уксусная кислота вызывает внутриклеточное закисление и отек тканей, тем самым противодействуя усадке тканей, вызванному метанолом.
Фиксация инактивирует ферменты и стабилизирует морфологию тканей для последующего окрашивания. Удалите излишки фиксаторов с помощью буфера. Инкубируйте ткань с эозином Y, кислотным красителем.
Эозин проникает в неподвижные клетки и попадает в цитоплазму. Кислая среда цитоплазмы в результате обработки уксусной кислотой вызывает максимальное протонирование аминогрупп цитоплазматических белков.
Эозин с отрицательно заряженными функциональными группами электростатически взаимодействует с протонированными группами белков, образуя стабильный краситель-белковый комплекс, и окрашивает цитоплазму в розовый цвет при накоплении. После инкубации разрежьте окрашенную почку на мелкие кусочки с последующим обезвоживанием тканей при повышении концентрации этанола.
Погрузите почечную ткань в парафин. Получите тонкие срезы ткани с помощью микротома. Далее регидратируйте срезы для микроскопического анализа.
Неокрашенные ядра клеток выглядят белыми на фоне окрашенной в розовый цвет цитоплазмы, что позволяет визуализировать микроструктуры почек, такие как проксимальные извилистые канальцы, состоящие из эпителиальных клеток с щеточной каймой, или собирательные протоки, которые выстланы уплощенными эпителиальными клетками без щеточных границ.
Начните с фиксации образцов мягких тканей. Наполните 50-миллилитровую центрифужную пробирку фиксирующим раствором, содержащим 9,5 миллилитров 4% формальдегида и 0,5 миллилитров ледяной уксусной кислоты. Добавьте образец мягких тканей в пробирку центрифуги и поставьте ее в холодильник на 24–72 часа.
После охлаждения промойте образец мягких тканей раствором DPBS в течение 1 часа. Затем окрасьте образец, поместив его в 2 миллилитра раствора эозина Y-окрашивания, и инкубируйте его на горизонтальной встряхивающей пластине в течение 24 часов.
На следующий день осторожно достаньте образец мягких тканей из контейнера для образца и удалите излишки красителя целлюлозной папиросной бумагой. Поместите его в коническую емкость над паровой фазой этанола для хранения и дальнейшего использования.