H&E окрашивание срезов тканей, залитых парафином: метод дифференциального окрашивания для визуализации срезов ткани печени с использованием комбинации гематоксилиновых и эозиновых красителей

Начните окрашивание гематоксилином и эозином с предметного стекла, содержащего срез ткани, залитый парафином. Окуните предметное стекло в раствор депарафинизации, содержащий ксилол – органический растворитель, который растворяет слой парафина вокруг ткани, делая его доступным для пятен на последующих этапах.

Обработайте участок ткани абсолютным спиртом, чтобы удалить ксилол. Погрузите ткань в уменьшающуюся концентрацию алкоголя. На этом этапе ткань регидратируется путем замены спирта водой для лучшей совместимости с водорастворимыми красителями.

Окрашивают ткань основным гематоксилином, который в окисленной форме связывается с протравой – катионом металла. Этот комплекс электростатически связывается с нуклеиновыми кислотами в геноме, окрашивая ядро в фиолетовый цвет.

Погрузите окрашенный участок в кислотный раствор для дифференцировки, чтобы удалить избыток гематоксилина из цитоплазмы, в результате чего ядро, удерживающее краситель, будет казаться отчетливым. Обработайте ткани щелочным синяющим средством для нейтрализации свободных кислот. Это регрессирует фиолетовый цвет красителя до синего, усиливая ядерные детали.

Погрузите предметное стекло в кислый раствор эозина, чтобы окрасить основные белковые компоненты в цитоплазме и волокна соединительной ткани в оттенки от красного до розового. Обработайте ткани спиртом для устранения избытка эозина. Используйте увеличивающиеся концентрации этанола для обезвоживания тканей. Окуните предметное стекло в ксилол, чтобы удалить остатки реагентов.

При визуализации клетки в тканевой части показывают прозрачные синие ядра и розовые цитоплазматические области.

Депарафинизируйте предметные стекла, погрузив их в 100% ксилол дважды, каждый раз на 15 минут. Затем регидратируйте предметные стекла с помощью этанолового градиента. Для каждого раствора окуните от 8 до 10 раз в течение двух секунд за каждое погружение, пока жидкость не стечет чисто со стекол. Поместите предметные стекла в 100% фильтрованный гематоксилин Харриса на четыре минуты.

Через четыре минуты быстро переложите их обратно в емкость с деионизированной водой. Запустите деионизированную воду в дальний от секций задний угол контейнера. Периодически опорожняйте емкость, пока вода не перестанет быть фиолетовой.

Быстро проверьте интенсивность гематоксилина на препарирующем микроскопе с помощью фонарей на гусиной шее. Верните предметные стекла в 100% гематоксилин на одну минуту, если требуется дальнейшее окрашивание.

Как только желаемое окрашивание гематоксилином будет получено, дважды окуните предметные стекла в 0,05% соляную кислоту, затем немедленно перенесите их обратно в емкость с чистой деионизированной водой. Опорожните и наполните емкость водой дважды.

Переложите предметные стекла в две емкости с 95% этанолом на 30 секунд каждая. Поместите предметные стекла в раствор эозина Y-флоксина-В на две минуты.

По прошествии двух минут перенесите предметные стекла обратно в прежнюю емкость с 95% этанолом, затем проверьте интенсивность цвета под микроскопом. Если окрашивание недостаточное, вернитесь к раствору эозина на 30 секунд. При необходимости повторите.

Когда будет получено окрашивание нужной интенсивности, перенесите предметные стекла на 100% изопропанол на 15 секунд. Замените его свежим 100% изопропанолом и поместите предметные стекла обратно в изопропанол еще на 15 секунд. Повторите этот процесс в общей сложности для шести промывок изопропанолом.

После погружения в 100% ксилол на три минуты снимите одно предметное стекло, добавьте достаточное количество монтажной среды, чтобы покрыть секции, а затем окуните предметное стекло в 100% ксилол.

Нанесите защитный лист на предметное стекло и промокните излишки монтажного материала на бумажном полотенце, пока не будет видна только тонкая линия. Затем окуните салфетку в ксилол и протрите заднюю часть предметного стекла, чтобы удалить всю капающую среду.

Положите предметное стекло на прочную, но подвижную поверхность, например, на кусок картона, и дайте ксилолу испариться в вытяжке в течение 10 минут. Оставьте предметные стекла при комнатной температуре на ночь, чтобы монтажная среда застыла перед нанесением изображения.