Окрашивание метиленовым синим для оценки образования метастатической колонии in vitro: процедура окрашивания для оценки метастазирования путем количественного определения раковых клеток, собранных на мышиной модели рака

Во время метастазирования рака опухолевые клетки первичной опухоли перемещаются по кровеносной системе, экстравазируются в отдаленные органы и образуют вторичные опухоли.

Для оценки метастазирования в легкие на мышиной модели рака молочной железы, которой были введены клетки 4Т1, клетки рака молочной железы с высоким уровнем метастатического развития, готовят клеточную суспензию, включающую клетки 4Т1, выделенную из собранных легких. Центрифугируют суспензию и ресуспендируют клетки в средах, содержащих 6-тиогуанин, 6-ТГ - аналог гуанина. Высейте клеточную суспензию в культуральную тарелку.

6TG проникает в нормальные клетки, где специфический фермент трансферазы превращает его в нуклеотид 6-TG, токсичный нуклеотид. Эти цитотоксические нуклеотиды встраиваются в ДНК, вызывая повреждение ДНК, и избирательно удаляют клетки из культуры. Клетки 4T1 имеют сниженную способность образовывать токсичные нуклеотиды, способствуя их выживанию и прилипанию к пластине. В зависимости от пролиферативной способности клеток они образуют колонии.

Обработайте клетки метанолом. Метанол проникает в клетки и денатурирует клеточные белки. Инкубируйте клетки с метиленовым синим.

Положительно заряженный краситель проникает в клетку, взаимодействует с отрицательно заряженной ДНК, интеркалируя в пространства между соседними парами оснований нитей ДНК. Он также связывается с РНК в цитоплазме, но с меньшим сродством. Ядра окрашиваются в темно-синий цвет из-за высокой концентрации ДНК, чем цитоплазма из-за низкой концентрации РНК. Метастатические колонии проявляются в виде синих точек.

Представьте себе табличку. Используйте программное обеспечение для определения метастатических колоний, количественно оценивая метастатическую нагрузку в легких мышей.

Доведите объем трубки до 10 миллилитров с помощью 1X HBSS. Затем вылейте содержимое через 70-микрометровое ячеистое ситечко в 50-миллилитровую коническую пробирку. С помощью поршня шприца объемом 1 миллилитр аккуратно протрите образец через ситечко.

Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 350-кратном избежании и выбросьте надосадочную жидкость. Затем дважды промойте гранулу 10 миллилитрами 1X HBSS. Ресуспендируйте гранулу в 10 миллилитрах 60 микромоляров 6-тиогуанина в полной питательной среде и поместите образцы в 10-сантиметровые клеточные культуральные планшеты, используя схему разведения, если это необходимо.

Выдерживайте пластины при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе в течение 5 дней. Слейте питательную среду с тарелок в соответствующий контейнер для отходов. Чтобы зафиксировать клетки, добавьте по 5 миллилитров неразбавленного метанола в каждую пластину и выдерживайте в течение 5 минут при комнатной температуре, обязательно взбалтывая метанол так, чтобы он покрывал всю пластину.

Вылейте метанол с тарелок в соответствующую емкость для отходов, затем промойте каждую пластину 5 миллилитрами дистиллированной воды. Добавьте 5 миллилитров 0,03% метиленового синего на тарелку и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, обязательно взболтав раствор метиленового синего так, чтобы он покрыл всю пластину. Насыпьте метиленовый синий в соответствующую емкость для отходов, и еще раз промойте каждую пластину 5 миллилитрами дистиллированной воды.

Переверните тарелку вверх дном и промокните ее о бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Поместите тарелку на крышку и дайте ей высохнуть на воздухе в течение ночи. Метастатические колонии будут синего цвета. Как только пластины высохнут, их можно хранить при комнатной температуре неограниченное время.