Периодическое кислотное окрашивание клеток: метод in vitro для определения уровня гликогена в мононуклеарных клетках периферической крови

Мононуклеарные клетки периферической крови, или PBMC, представляют собой циркуляторные клетки крови с одиночными крупными ядрами, состоящими из В- и Т-лимфоцитов, естественных киллеров, моноцитов и дендритных клеток. PBMC хранят избыток глюкозы в полимерной форме в виде гликогена - разветвленного полисахарида - в своей цитоплазме.

Чтобы определить присутствие гликогена в ПМЦ, необходимо подготовить однородный мазок выделенных ПМК на предметном стекле. Обрабатывайте клетки формалином - фиксирующим раствором, который сшивает клеточные биомолекулы, сохраняя структурную целостность ПМЦ.

Частично погрузите предметное стекло в раствор амилазы. Этот фермент проникает в клетки и гидролизует гликоген в обработанных клетках. Это приводит к образованию двух различных клеточных популяций - обработанных ферментами, с дефицитом гликогена, и клеток, не обработанных амилазой, богатых гликогеном.

Покройте их периодическим раствором кислоты, который окислительно преобразует гидроксильные группы молекул гликогена в альдегиды.

Промойте предметное стекло в воде, чтобы остановить реакцию окисления и удалить избыток периодической кислоты. Обработайте предметное стекло реагентом Шиффа, который вступает в реакцию с альдегидными группами гликогена, периодически обработанного кислотой, образуя нерастворимый комплекс пурпурного цвета.

Применяйте монтажные среды для ограничения клеток во время визуализации. Установите покровное стекло, чтобы распределить монтажный материал по всей поверхности слайда для лучшей визуализации. Представьте себе окрашенные клетки.

Клетки, не обработанные амилазой, содержат гранулы пурпурного гликогена, отсутствующие в клетках, обработанных ферментами.

На этом этапе поместите предметное стекло на ровную поверхность. Нанесите на образец 2 миллилитра раствора периодической кислоты, и выдержите в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем несколько раз промойте предметное стекло дистиллированной водой. Нанесите на предметное стекло 2 миллилитра реактива Шиффа, и выдержите при комнатной температуре в течение 15 минут.

Впоследствии промойте предметное стекло дистиллированной водой в течение 5 минут, а затем дайте ему высохнуть на воздухе. Далее нанесите на предметное стекло 100 микролитров монтажного носителя и накройте его одним большим покровным стеклом, или нанесите 50 микролитров и используйте два маленьких покровных стекла. После этого нанесите прозрачный лак для ногтей по краям покровного стекла. Дайте им высохнуть на ночь.

Затем получите изображения с помощью бинокулярного светового микроскопа с объективом 100X.