Окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом: метод визуализации устойчивых к лекарствам раковых клеток с помощью анализов на образование колоний

В гетерогенной популяции опухолевых клеток лечение противораковым препаратом убило бы большинство клеток, но устойчивые к лекарствам клетки выживают, что приводит к терапевтической неудаче.

Чтобы определить долю устойчивых к лекарствам клеток, засейте популяцию гетерогенных опухолевых клеток в многолуночный планшет. Инкубируйте для облегчения адгезии клеток. Добавляйте в возрастающую концентрацию подходящий противоопухолевый раствор препарата.

Взаимодействие с молекулами препарата приводит к гибели чувствительных клеток и, впоследствии, к их отделению от культивальных планшетов. Напротив, лекарственно-устойчивые клетки выживают и остаются прикрепленными к пластине.

Отсадите отработанную среду, чтобы удалить отслоившиеся клетки. Добавьте свежую немедикаментозную среду и инкубируйте планшет в физиологических условиях. Лекарственно-устойчивые клетки размножаются и образуют колонии опухолей. Теперь добавьте в колонии кристаллический раствор для окрашивания фиолетового цвета и инкубируйте.

Кристаллический фиолетовый, фиолетовый, проницаемый для мембран, положительно заряженный краситель проникает в клетки и связывает анионные белки и ДНК, тем самым придавая клеткам фиолетовый цвет.

Далее добавьте этанол для растворения непрореагировавшего пятна. Вымойте, чтобы удалить лишнее пятно, и высушите тарелку на воздухе.

Устойчивые к лекарствам колонии проявляются в виде фиолетовых точек. Посчитайте количество цветных колоний в каждой лунке. Представьте процент жизнеспособности клеток на графике, чтобы определить долю устойчивых к лекарствам раковых клеток при каждой концентрации препарата.

При этой процедуре в планшет помещают 2000 клеток, используя 2 миллилитра среды на лунку, в 6-луночные планшеты. Через 24 часа добавьте возрастающие концентрации доцетаксела для клеточных линий DU145 и 22Rv1. Добавляйте ДМСО только в одну лунку в качестве контроля в том же объеме, который используется для самой высокой дозы доцетаксела.

Через 72 часа аспирируйте среду, содержащую лекарство, и добавьте свежую среду, не содержащую доцетаксела. Инкубируйте планшеты в течение одной-двух недель, пока колонии не станут видны под микроскопом.

Чтобы окрасить колонии, аккуратно промойте их 2-3 миллилитрами PBS и инкубируйте с двумя-тремя миллилитрами кристаллического фиолетового раствора в течение 20 минут внутри вытяжного шкафа для культуры тканей или вытяжного шкафа. После этого удалите раствор для окрашивания и промойте тарелки 2-3 миллилитрами воды. Затем удалите воду и просушите пластины на воздухе.

Сделайте цифровые изображения пластин для представления фигуры. Анализируйте результат, визуализируя лунки, и вручную подсчитывая колонии с помощью маркера.